НЕЙРОХИМИЯ, 2014, том 31, № 4, с. 307-313
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫЕ РАБОТЫ
УДК 577.3
ИССЛЕДОВАНИЕ КИНЕТИЧЕСКИХ ХАРАКТЕРИСТИК ЛАКТАТДЕГИДРОГЕНАЗЫ МОЗГА КРЫС ПРИ ИШЕМИИ И РЕПЕРФУЗИИ © 2014 г. Р. А. Халилов1, А. М. Джафарова1 *, Р. Н. Джабраилова1, Э. З. Эмирбеков1 2
Дагестанский государственный университет, Махачкала 2Южный федеральный университет, Ростов-на-Дону
Исследованы активность и кинетические характеристики лактатдегидрогеназы (ЛДГ) при частичной глобальной ишемии и реперфузии мозга крыс. Обнаружено, что при окклюзии сонных артерий в течение одного часа активность ЛДГ растет во всем диапазоне исследованных концентраций пи-рувата. При этом характер концентрационной зависимости активности фермента не изменяется, а К для области ингибирования избытком пирувата незначительно увеличивается. Повышение эффективности катализа ЛДГ при ишемии обусловлено повышением Утяк на фоне незначительного снижения Кт. При постишемической реперфузии мозга активность ЛДГ при всех исследованных концентрациях пирувата уменьшается. При этом точка оптимума на графике концентрационной зависимости смещается в область более высоких концентраций пирувата, что связано с уменьшением К Драматическое уменьшение эффективности катализа обусловлено значительным повышением Кт и уменьшением значения Ктах. Обсуждаются возможные механизмы обнаруженных изменений активности и кинетических характеристик ЛДГ при ишемии и реперфузии мозга.
Ключевые слова: лактатдегидрогеназа, мозг, кинетические характеристики, ишемия, реперфузия, крысы.
Б01: 10.7868/81027813314040049
Ишемический инсульт является проблемой чрезвычайной медицинской и социальной значимости [1]. Ишемия представляет собой ухудшение (неполная) или полное прекращение (тотальная) всех трех функций локального кровоснабжения: доставки кислорода в ткань, доставки пластических веществ — субстратов окисления и удаление продуктов метаболизма [2]. Снижение мозгового кровотока приводит к развитию каскада биохимических изменений ("ишемический каскад"), что в итоге сопровождается необратимым повреждением нервной ткани по механизмам некроза или апоптоза [3]. Первопричиной запуска "ишемического каскада" является критическое уменьшение концентрации кислорода в нервной ткани, приводящее к снижению скорости аэробного окисления в митохондриях и соответственно к падению концентрации АТФ в клетках. Снижение отношения АДФ/АДФ + АМФ, в свою очередь, активирует фосфофруктокиназу — ключевой фермент гликолиза. В условиях дефицита энергии гликолиз — единственный источник энергии для нейронов. Конечным продуктом гликолиза является
*Адресат для корреспонденции: 367018, Махачкала, Проспект Петра I, д. 55, тел.: 8(8722)65-03-58; e-mail: albina19764@mail.ru.
лактат, нарастание концентрации которого провоцирует внутриклеточный ацидоз. На начальных этапах ишемии ацидоз можно рассматривать как компенсаторно-приспособительную реакцию, способствующую увеличению перфузии в зоне пе-нумбры [4]. Однако значительное нарастание концентрации лактата может привести к неблагоприятным последствиям и является плохим диагностическим признаком [5].
Возникновение лактат-ацидоза оказывает многокомпонентное цитотоксическое действие на нейроны и глию, что связано с "разрыхлением" — в кислой среде клеточных мембран, нарушением секвестрации Са2+ в митохондриях и эн-доплазматической сети (вследствие конкуренции ионов Н+ и Са2+ за места связывания), накоплением внутриклеточного свободного Са2+ и дополнительной активацией запускаемых Са2+ патогенетических механизмов (усиление свободноради-кального окисления и перекисного окисления липидов, активация липаз, протеаз). Накопление ионов Н+ является одним из основных факторов развития отека мозга. Начальное увеличение тканевой жидкости вызывает цитотоксический эффект, способствуя нарушениям энергетического метаболизма [6].
Столь важная роль анаэробного гликолиза в патогенезе мозга при ишемии предполагает необходимость изучения функционирования его ключевых ферментов, одним из которых является лактатдегидрогеназа (ЛДГ). ЛДГ — это цитозоль-ный фермент, стоящий на стыке аэробного и анаэробного метаболизма и осуществляющий взаимопревращения лактата и пирувата [7].
ЛДГ — это тетрамер, в образовании которого могут служить субъединицы двух типов — М (А) и Н (В). В мозге обнаружены все пять изоформ ЛДГ, причем, в самих нейронах наиболее распространена ЛДГ1, преимущественно катализирующая обратную реакцию — превращение лактата в пи-руват, а в астроцитах ЛДГ5, катализирущая прямую реакцию — превращение пирувата в лактат [8]. Между глией и нейронами существует пул обмена лактатом, так называемый "лактатный шаттл", обеспечивающий нейроны лактатом — основным источником энергии при их функциональной активности [9]. В условиях дефицита кислорода лактат не утилизируется в митохондриях нейронов, а накапливается в клетках и межклеточном пространстве [10]. Таким образом, высокое производство лактата в ишемированном мозге, скорее всего, происходит за счет изменения активности ЛДГ5.
Ранее Щербак с соавт. [11] обнаружили существенные изменения активности ЛДГ в различных структурах мозга при ишемии и реперфузии. Эти изменения могут отражать как проявление процессов адаптации к новым условиям, так и патологические процессы, вызванные действием экстремального фактора. Исследование кинетических характеристик ЛДГ, предпринятое в данном исследовании, может стать важным шагом в раскрытии молекулярных механизмов ее компенсаторно-приспособительных и патологических реакций в ответ на ишемию и реперфузию мозга.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
Объект исследования. Исследования проводили на белых беспородных крысах (обоих полов) массой 150—200 г. Животные содержались в условиях вивария на обычном рационе. Время проведения экспериментов (с 9 до 12 ч) строго соблюдалось, во избежание влияния суточных колебаний на результат эксперимента.
Моделирование ишемии мозга. Ишемия головного мозга осуществлялась полной перевязкой обеих сонных артерий под наркозом (тиопентал, 40 мг/кг) в течение 60 мин. Для создания реперфу-зионной модели ишемического повреждения на обе общие сонные артерии на 60 мин накладывались клипсы, после чего кровоток по общим сонным артериям восстанавливали (60 мин), добиваясь реперфузии ранее ишемизированной ткани. В
качестве контроля использовались ложноопери-рованные крысы.
Получение тканевого экстракта. Животных декапитировали, выделяли мозг. Навеску ткани (1—2 г) измельчали и гомогенизировали с четырьмя объемами 0.1 М фосфатного буфера (рН 7.4). Гомогенат центрифугировали при 600 g в течение 10 мин. Центрифугат, профильтрованный через четыре слоя марли, повторно центрифугировали при 15000 g в течение 10 мин. Полученный супер-натант хранили в холодильнике при 4°С.
Определение активности ЛДГ. Активность ЛДГ определяли по убыли содержания NADH в реакционной смеси в результате энзиматического восстановления пирувата в лактат, что регистрировалось спектрофотометрически (на длине волны 340 нм в течение 2 мин). Реакционная смесь содержала 2.4 мл 0.1 М фосфатного буфера (рН 7.4), 0.3 мл раствора пирувата натрия ("Sigma", США), 0.3 мл 1 мМ раствора NADH ("Sigma", США) и 0.05 мл тканевого экстракта, содержащего 25 мкг белка. Исследование активности ЛДГ проводили в диапазоне концентраций пирувата от 0.1 до 25.6 мМ. По результатам строили графики концентрационной зависимости.
Активность ЛДГ выражали в наномолях НАДН, окисленного в результате ферментативной реакции за 1 мин на 1 мг белка (нмоль/мин • мг белка).
Определение белка. Содержание белка определяли по методу Лоури [12].
Определение кинетических характеристик. Для определения кинетических характеристик (максимальной скорости (Vmax), константы Михаэли-са (Km) и константы ингибирования Kj) по концентрационной зависимости скорости окисления NADH методом наименьших квадратов, использовали пакет STATISTICA. В опции "нелинейное оценивание" использовали уравнение Холдейна.
Статистическая обработка результатов. Обработку данных вели с использованием пакета STATlSTICA. Достоверность различия определяли с помощью критерия Стьюдента на уровне значимости P = 0.05. Каждая кривая на графиках концентрационной зависимости скорости окисления NADH — среднее восьми независимых экспериментов. Данные в таблице приведены в виде: среднее ± ошибка среднего.
РЕЗУЛЬТАТЫ
Исследована концентрационная зависимость ферментативной активности ЛДГ мозга крыс в норме (ложнооперированные крысы), при неполной глобальной ишемии (окклюзия сонных артерий в течение 60 мин) и последующей репер-фузии в течение 60 мин (рисунок).
График концентрационной зависимости ЛДГ мозга крыс имеет колоколообразную форму, т.е.
Кинетические характеристики ЛДГ мозга крыс в норме, при ишемии и ишемии-реперфузии (п = 8)
№ Состояние животного Кинетические характеристики
V ' тах Кт К; ^тах/Кт [8]ор1 А = К, - Кт
1 Контроль 271.05 ± 11.32 0.43 ± 0.03 21.85 ± 1.07 620.25 ± 26.3 3.09 ± 0.08 21.42 ± 1.03
2 Ишемия 352.86 ± 15.81 Р2-1 < 0.05 0.36 ± 0.02 23.21 ± 0.82 980.17 ± 24.9 Р2-1 < 0.01 2.89 ± 0.11 22.85 ± 0.45
3 Ишемия-реперфузия 180.72 ± 7.91 Р3-1 < 0.05 Р3_2 < 0.01 0.77 ± 0.03 Р3-1 < 0.01 Р3_2 < 0.01 15.42 ± 0.80 Р3-1 < 0.05 Р3_2 < 0.05 204.17 ± 11.02 Р3-1 < 0.001 Р3_2 < 0.001 3.45 ± 0.21 Р3_2 < 0.05 14.65 ± 0.58 Р3-1 < 0.05 Р3_2 < 0.05
скорость катализа ЛДГ растет с повышением концентрата пирувата до определенного максимального значения, а затем, по мере дальнейшего повышения концентрации пирувата, падает. Таким образом, кинетика лактатдегидрогеназной реакции мозга крыс характеризуется наличием субстратного ингибирования, что согласуется с данными как зарубежных авторов [13], так и с собственными данными, полученными при исследовании кинетики ЛДГ скелетных мышц [14].
Окклюзия сонных артерий в течение одного часа мозга не сказывается на характере концентрационной зависимости ЛДГ, однако при этом активность фермента растет во всем диапазоне исследованных концентраций пирувата. Так, например, при концентрации пирувата 3.2 мМ (соответствующей оптимальной) повышение составляет 36.1%. Восстановление кровото
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.