ФИЗИОЛОГИЯ РАСТЕНИЙ, 2014, том 61, № 3, с. 449-456
МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
УДК 581.1
ИССЛЕДОВАНИЕ КИНЕТИЧЕСКИХ ПАРАМЕТРОВ ФЛУОРЕСЦЕНЦИИ ХЛОРОФИЛЛА В ЛИСТЬЯХ Ficus benjamina МЕТОДОМ ВИДЕОРЕГИСТРАЦИИ
© 2014 г. В. С. Лысенко*, Т. В. Вардуни*, П. O. Косенко**, Ю. В. Косенко**, О. И. Чугуева**, Л. В. Семин*, И. А. Горлачев*, Е. К. Тарасов*, О. С. Гуськова*
*Южный федеральный университет, научно-исследовательский институт биологии, Ростов-на-Дону **Южный федеральный университет, факультет естественно-научного и математического образования,
Ростов-на-Дону Поступила в редакцию 23.08.2013 г.
Подробно описан метод визуализации и анализа кинетических параметров флуоресценции хлорофилла, распределенных по площади листа. Видеоданные, зарегистрированные с помощью CCD-камеры, анализировали с использованием программ VirtualDub и ImageJ. Метод позволяет не только визуализировать распределение индекса спада флуоресценции (Rfd), но и получить фотоиндукционные кривые флуоресценции, соответствующие любым участкам, выбранным на изображении листа. Показана выраженная мозаичность теневых листьев Ficus benjamina L. по величине индекса спада флуоресценции Rfd, функциональное значение которой обсуждается с точки зрения адаптации к освещению различной интенсивности. Обнаружена значительная неоднородность листа F. benjamina по времени выхода вторичного максимума флуоресценции (пик М). Предложенный метод получения дифференциальных изображений позволил визуализировать эту неоднородность и продемонстрировать существование ранее неизвестного феномена распространения вторичной "волны" флуоресценции хлорофилла вдоль поверхности листьев. Показано также отсутствие пика М в хлорофилл-дефицитных, лишенных мезофилла секторах листьев, где остаточный хлорофилл относится к хлоропластам замыкающих клеток устьиц.
Ключевые слова: Ficus benjamina - флуоресценция хлорофилла - видеорегистрация флуоресценции -пестролистность — хлорофилл-дефицитные ткани - адаптация листьев к свету - цифровая обработка изображений - ImageJ
DOI: 10.7868/S0015330314030087
ВВЕДЕНИЕ
Анализ кинетических параметров флуоресценции хлорофилла является широко распространенным подходом к изучению механизмов световых реакций фотосинтеза как в фундаментальном, так и в прикладном аспектах [1]. Впервые кинетика флуоресценции зеленых тканей растений была обнаружена Kautsky и Hirsch [2], показавшими, что после включения актиничного света интенсивность флуоресценции листьев быстро
Сокращения: ЭТЦТ - электрон-транспортная цепь тилакои-дов; CET-PSII и CET-PSI - циклический транспорт электронов в электрон-транспортной цепи тилакоидов вокруг фотосистем I и II; LET - линейный транспорт электронов; PPFD - плотность потока фотосинтетически активной радиации; Rfd - индекс спада флуоресценции (индекс жизнеспособности).
Адрес для корреспонденции: Лысенко Владимир Сергеевич. 344090 Ростов-на-Дону, просп. Стачки, 194/1. НИИ биологии Южного федерального университета. Электронная почта: vs958@yandex.ru
(за 1-5 с) возрастает и затем медленно (в течение нескольких минут) падает. Впоследствии эффект Каутского стал предметом изучения в огромном количестве работ в области фотосинтеза (см. обзоры [3-5]). В качестве примеров использования параметров кинетики флуоресценции в исследованиях физиологии фотосинтеза можно привести недавно выполненные работы, в которых изучали передачу фотоиндуцированного сигнала с потоком подвижной цитоплазмы [6], влияние фито-гормонов на эмбриогенез бурых водорослей Fucus [7], воздействие засухи на проростки сахарной свеклы [8].
Установлено, что в основе эффекта Каутского лежат изменения окислительно-восстановительного статуса пула первичного акцептора QA, входящего в состав электрон-транспортной цепи тилакоидов (ЭТЦТ) [9]. В условиях темновой адаптации первичный акцептор QA полностью окислен. В первый момент после включения све-
10
449
та электроны синглетно-возбужденной молекулы хлорофилла реакционного центра (РЦ) используются для восстановления рА. Флуоресценция в этом случае минимальна (/0), а фотохимическое тушение флуоресценции максимально. Однако в течение 1-5 с пул РА практически полностью восстанавливается, причем его повторное окисление сильно затруднено, поскольку полная активация ЭТЦТ требует некоторого времени. В результате флуоресценция возрастает до пикового значения (/р) и через несколько минут снижается до стационарного уровня (/.) [9, 10]. В большинстве случаев через 5-15 с наблюдается повторный (медленный и низкоамплитудный) максимум (М-пик), обусловленный увеличением потребления АТФ в ходе индукции цикла Кальвина, что приводит к временной релаксации ДрН и снижению нефотохимического тушения флуоресценции [11]. В свою очередь, индукция цикла Кальвина, как и амплитуда пика М, зависит от концентрации восстановленного НАДФ+, определяемой доступностью и уровнем фотосинтетической фиксации С02 [12, 13]. Параметры пика М, отражая функциональное состояние фотосинтетической системы, могут быть применены, например, для оценки перераспределения поглощенной световой энергии между ФС I и ФС II [14].
Важным и часто используемым в настоящее время (см. [15, 16]) показателем квантовой эффективности фотосинтеза является отношение вариабельной флуоресценции к максимальной: FY/Fm, где FY = Шт — F0, причем Шт измеряется в момент мощной вспышки, насыщающей фотосинтез [4, 17].
Альтернативной количественной характеристикой фотосинтеза может служить индекс спада флуоресценции ШИ = (Др - известный так-
же как индекс жизнеспособности, где Др - максимальная (в пределах фотоиндукционной кривой) флуоресценция хлорофилла в условиях ненасыщающего света [18, 19]. Величина ШИ более чувствительна к внешним воздействиям, чем величина Д/Дп, и хорошо коррелирует с удельной скоростью фотосинтетической фиксации С02 в нормальных зеленых тканях [20, 21]. Регистрация флуоресценции, производимая с целью дальнейшего определения ее кинетических параметров (ШИ и Ду/Дт), чаще всего осуществляется с помощью чувствительных фотодиодов, используемых отдельно или в составе РАМ-флуориметров. При этом в процессе исследования одного объекта (листа или его части) можно получить только одну кривую, отражающую интегральный уровень флуоресценции. В то же время для решения ряда научных задач в области физиологии растений необходимо или желательно выявить картину распределения значений кинетических парамет-
ров флуоресценции по площади объекта. К ним могут быть отнесены, к примеру, исследования листьев пестролистных растений, исследования функциональной неоднородности листьев, а также все случаи, когда необходимо выявить результат прямого воздействия каких-либо внешних факторов на фотосинтез локальных участков листовой пластинки в сравнении с прилежащими участками, не подвергшимися прямому влиянию изучаемого фактора. Такими факторами являются, в частности, инфекционные поражения, локальный нагрев, охлаждение и действие других физических раздражителей.
Изучение распределенных кинетических параметров флуоресценции зеленых тканей может быть эффективно выполнено с помощью CCD-видеокамеры. Так, Lichtenthaler с сотр. [19] были получены данные о распределении величины Rfd по площади световых и теневых листьев платана. Авторы произвели попиксельное деление изображений, полученных во временных точках, соответствующих достижению значений Fp и Fs, причем каждое такое изображение усреднялось из нескольких десятков отдельных кадров. Деление и последующую обработку изображений осуществляли с использованием программы Camille 1.05 ("Photonetics", Германия).
В настоящей работе подробно описан метод, позволяющий не только получить визуализированные данные распределения Rfd, но и фотоиндукционные кривые флуоресценции, соответствующие любым интересующим участкам, выбранным на изображении листа. Краткое описание метода было изложено нами ранее в работе [22], в которой изучали световые реакции хлорофилл-дефицитных секторов F. benjamina, и в работе [23], в которой исследовали мембрано-тропные эффекты полученного нами комплекса каротиноидов радиорезистентной бактерии Deinococcus radiodurans [24] на кинетику флуоресценции хлорофилла в микропрепаратах Atriplex hortensis.
Кроме того, в ходе исследований, выполненных с применением описанного метода, впервые установлено существование значительных различий времени выхода вторичного пика М фотоиндукционных кривых флуоресценции между разными участками одной и той же листовой пластинки. Показано, что такие отличия лежат в основе обнаруженного и визуализированного в настоящей работе, ранее неизвестного феномена индукционной вторичной "волны" флуоресценции хлорофилла, распространяющейся вдоль поверхности листьев. Высказано предположение, что природа этой поверхностной волны (как и сам пик M) может быть связана с обменом углекислого газа.
Использованный в работе метод основан на применении свободно распространяемых компьютерных программ VirtualDub и ImageJ.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
Пестролистные растения Ficus benjamina L. (Golden King) высотой 18-22 см, выращивали в климатической камере в стандартных условиях [22]: температура 25 ± 1°C; относительная влажность воздуха 70%; относительная влажность почвы 60%; режим день/ночь 16/8 ч; плотность потока фотосинтетически активной радиации (PPFD) 510 мкмоль фотонов/(м2 с). Для экспериментов отбирали листья длиной 35-45 мм, окаймленные периферическими секторами светло-зеленой окраски, частично утратившими мезофилл, или секторами, полностью утратившими мезофилл и имеющими следы зеленой окраски, где остаточный хлорофилл содержится только в замыкающих клетках устьиц (альбино-сектора). Характеристики листьев разных типов описаны нами в недавней работе [22].
Для визуальных исследований флуоресценции применяли черно-белую CCD-видеокамеру VNC-748-H3 ("ЭВС", Россия), имеющую сверхвысокую чувствительность (4 х 10-4 лк) и функции ручного управления. На камере устанавливали светосильный (F1.2) объектив (TTSH0612, "AVENIR", Япония) и интерференционный светофильтр (690 ± 5 нм, "ESCO products", США). Чувствительность сенсора камеры в регистрируемой спектральной обла
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.