БИОЛОГИЧЕСКИЕ МЕМБРАНЫ, 2007, том 24, № 3, с. 251-258
УДК 557.353.465
ИССЛЕДОВАНИЕ КИНЕТИКИ АЛАМЕТИЦИНОВОГО КАНАЛА ФЛУКТУАЦИОННЫМ И МУЛЬТИФРАКТАЛЬНЫМ ФЛУКТУАЦИОННЫМ МЕТОДАМИ
© 2007 г. М. Е. Асташев, В. Н. Казаченко, П. А. Григорьев
Институт биофизики клетки РАН, 142290 Пущино Московской области; тел.: 925-59-84; факс: (4967)33-05-09; электронная почта: astashev@icb.psn.ru Поступила в редакцию 05.06.2006 г.
Методы флуктуационного анализа и мультифрактального флуктуационного анализа были применены для анализа кинетики аламетицинового канала, встроенного в БЛМ. Метод флуктуационного анализа показал, что последовательности событий, сформированные как из времен жизни на фиксированных уровнях проводимости канала, так и из открытых состояний на всех уровнях проводимости, представляют собой случайные процессы. Напротив, методом мультифрактального флуктуационного анализа установлено, что случайными являются только выборки времен жизни на фиксированных уровнях проводимости, а последовательности событий, включающие времена жизни на всех исследованных подсостояниях проводимости, представляют собой мультифрактальный скор-релированный процесс.
Как правило, кинетику ионных каналов представляют в виде стационарного марковского процесса [1-3]. При таком описании константы переходов канала между его состояниями являются постоянными и не зависят от времени пребывания канала в предшествующем состоянии. Ряд экспериментальных исследований подтверждает такое представление об активности каналов. Для некоторых типов каналов (например, КСа-каналов культивируемых мышечных клеток) существует обратная зависимость между длительностями соседних одиночных импульсов тока и интервалами между ними [1, 3, 4]. При этом изменялось соотношение вероятностей нахождения канала в его состояниях, однако константы скоростей перехода канала между ними не зависели от предыдущей активности канала. При использовании марковского описания выявленная корреляция могла бы указывать на существование двух и более независимых путей, связывающих открытые и закрытые состояния [1, 3, 4].
В последнее время интенсивно изучается альтернативная модель воротного механизма, основанная на теории фрактальных процессов [5-7]. Согласно этой модели, все кинетические подсостояния скоррелированы. Это свойство было подтверждено на некоторых типах ионных каналов тем, что распределения времен жизни канала в различных состояниях самоподобны: в различных временных масштабах они представлены единственной (основной) экспонентой. Впоследствии для описания активности каналов была предложена детерминистическая модель, в которой "воротный" механизм модулировался некоторой гипотетической силой
[8]. Позднее для анализа кинетики были использованы более адекватные методы. С помощью метода нормированного размаха, примененного для описания Са2+-активируемых каналов клеток Лей-дига [9, 10] и культивируемых почечных клеток Vero [11, 12], было установлено следующее. В первом случае показатель Херста H оказался равным 0.6^0.7 и превысил критический уровень 0.5, характерный для случайных процессов. Во втором случае величина H не только заметно превышала уровень 0.5, но и имела по крайней мере два значения: на малых масштабах (интервалах разбиения последовательности l, величиной от единиц до сотен событий) H ~ 0.6, на б0льших (от сотен до десятков тысяч событий) - 0.8^0.9. Граница перехода воротного механизма канала из одного режима работы в другой (точка перегиба), в пересчете на временну ю шкалу, составляет 0.1-1 с. Это свидетельствует о том, что кинетика ионных каналов представляет собой не простой фрактальный, а более сложный процесс. Другие методы анализа фрактальных свойств процесса (Фурье-преобразование, вейвлет-преобразование, определение локальных значений h) показали, что воротный процесс КСа-каналов и потенциалозависимых К+-кана-лов является персистентным мультифрактальным процессом [13-16].
Каналы в биологических мембранах имеют сложную структуру. Они состоят из большого числа субъединиц, так что в некоторых случаях их молекулярная масса может составлять более 1000 кДа [17]. В таком канале возможно образование фрактальной кинетики за счет остаточной деформации сопрягаемых при конформационных
0.2 с
Рис. 1. Запись активности аламетицинового канала и результат дифференцирования сигнала для последующего выделения интервалов времени между переключениями проводимости канала. а - Запись активности представляет собой последовательность переключений канала между подсостояниями с проводимостью 0.4, 2.0, 4.4, 6.6, 9.6 и 12.6 нСм. б - Дифференцированная запись активности. Шумовая линия посередине соответствует нахождению канала в стационарном подсо-стоянии проводимости. Выбросы вверх и вниз соответствуют переходам между подсостояниями на уровень вверх и вниз соответственно. При анализе измеряли промежутки времени между выбросами (независимо вверх или вниз) амплитудой более 1 мкСм/с.
переходах поверхностей глобулы при работе воротного механизма канала.
Для сопоставления кинетики мы исследовали активность аламетицинового канала, встроенного в БЛМ. Аламетицин - полипептид с молекулярной массой 1.7 кДа, состоящий из 18 аминокислотных остатков. Этот полипептид известен как антибиотик И22324 со сравнительно небольшой активностью [18, 19]. Аламетицин содержит необычную аминокислоту - а-метиламин [18]. Он способен образовывать в БЛМ ионные потенциалозависимые каналы со слабой катионной селективностью, которые также проницаемы для аниона Cl-. Канал, образуемый аламетицином, имеет пять-семь подсо-стояний проводимости с примерно равными по величине интервалами между подсостояниями (около 2500 пСм при 2 М KCl с обеих сторон мембраны) [19]. Эта величина на порядок выше проводимости Са2+-активируемого К+-канала и на два-три порядка выше проводимости потенциалозависимого К+-канала. Считая, что проводимость канала линейно зависит от концентрации токопереносящего иона, 7-й уровень проводимости аламетицинового канала эквивалентен проводимости потенциалозависимого К+-канала при концентрации проникающего иона 100 мМ с обеих сторон мембраны.
Механизм образования поры аламетицинового канала лежит в основе особенностей кинетики его переходов. Одни авторы полагают, что пора представляет собой "бочонок", состоящий из отдельных молекул аламетицина. Каждое подсостояние в этом случае образуется в результате встраивания в "бочонок" дополнительной "клепки" - молекулы аламетицина (мономера) [19, 20]. Другие исследователи считают, что аламетициновый канал - это кластер, состоящий из мономеров - отдельных "бочонков" из аламетицина [21]. Воротный механизм аламетицинового канала остается неизвестным. Можно предположить, что подобно воротному механизму канала в биологических мембранах, он образуется из отдельных аминокислотных остатков, входящих в структуру канала [19, 21].
Мы исследовали кинетику аламетицинового канала методами бестрендового флуктуационного анализа (БФА) [23] и мультифрактальным методом бестрендового флуктуационного анализа (МФ-БФА) [24]. Кроме того, в данной работе мы оценили распределение локальных показателей Гельдера h(N) [25]. Применение указанных методов анализа кинетики ионных каналов позволило впервые сопоставить их результаты.
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ
Методика регистрации ионных токов аламети-циновых каналов описана ранее [22]. Магнитофонную запись токов оцифровывали (DigiData1322, Molecular Devices) и сохраняли на жестком диске компьютера (PClamp 9, Molecular Devices).
Определение времен жизни канала (рис. 1а) проводили двумя методами. Согласно первому методу, определяли времена жизни канала в каждом проводящем состоянии. Например, для определения времени жизни канала на n-м уровне устанавливали два пороговых уровня амплитуды тока: посередине между уровнями (n - 1, n) и посередине между уровнями (n, n + 1). Время жизни канала на уровне n определяли как время нахождения канала между пороговыми уровнями. Таким образом, для каждого уровня проводимости получали свой собственный ряд событий. Такие ряды далее в тексте обозначены одной цифрой, соответствующей номеру подсостояния (например, 3). Согласно второму методу, были получены ряды времен жизни канала между моментами перехода канала из состояния с одним значением проводимости в состояние с другим ее значением без учета номера подсостояния, но по порядку следования событий. Для этого запись активности канала (рис. 1а) дифференцировали (рис. 16). Полученная кривая скорости изменения проводимости от времени имела вид шумовой линии со средним значением равным нулю и выбросами вверх и вниз от нулевой линии, которые соответствовали переходам канала на более высокий и более низкий уровень проводимости.
а
ИССЛЕДОВАНИЕ КИНЕТИКИ АЛАМЕТИЦИНОВОГО КАНАЛА
253
Далее эту зависимость обрабатывали с помощью порогового алгоритма, позволяющего выделить интервалы времени между всплесками. Такие ряды данных обозначены "Все". Во всех случаях из выборки удаляли времена жизни длительностью менее достоверно разрешимого значения.
Полученные последовательности анализировали методами фрактального и мультифрактально-го анализа.
1. Метод бестрендового флуктуационного анализа (БФА) [23] отличается от Я/£-анализа тем, что на каждом из интервалов разбиения выборки I удаляется тренд (линейный в нашем случае), причем оценкой разброса Я является флукту-ационная функция Ес(1).
2. Мулътифракталъный БФА (МФ-БФА) [24] отличается от вышеуказанного метода построения функции флуктуации тем, что вместо второго момента (д = 2) используется обобщенный показатель д, который проходит ряд значений д = -15-15 с шагом 0.5. В рамках мультифрактального анализа событий функция флуктуации определяется следующим образом:
Fß)
г N . 1/q
Fq(l) = | N![F2<l'v)]И •
L v = 1
Fq ( l)~ l
h (q)
(1)
(2)
Здесь Р-(1, у)-вариация последовательности с удаленным трендом; V = 1, 2, ... N , где N I - число событий на фрагменте длиной I исследуемой выборки; И(д) - показатель Херста, зависящий от д. При д = = 2 рассматриваемый метод идентичен стандартному методу БФА [24]. Мультифрактальный анализ событий п
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.