научная статья по теме ИССЛЕДОВАНИЕ КИНУРЕНИНОВОГО ПУТИ МЕТАБОЛИЗМА ТРИПТОФАНА МЕТОДОМ КАПИЛЛЯРНОГО ЭЛЕКТРОФОРЕЗА И МАСС-СПЕКТРОМЕТРИИ Химия

Текст научной статьи на тему «ИССЛЕДОВАНИЕ КИНУРЕНИНОВОГО ПУТИ МЕТАБОЛИЗМА ТРИПТОФАНА МЕТОДОМ КАПИЛЛЯРНОГО ЭЛЕКТРОФОРЕЗА И МАСС-СПЕКТРОМЕТРИИ»

ОРИГИНАЛЬНЫЕ СТАТЬИ

УДК 543.54

ИССЛЕДОВАНИЕ КИНУРЕНИНОВОГО ПУТИ МЕТАБОЛИЗМА ТРИПТОФАНА МЕТОДОМ КАПИЛЛЯРНОГО ЭЛЕКТРОФОРЕЗА

И МАСС-СПЕКТРОМЕТРИИ

© 2011 г. А. А. Сидорова*, Л. А. Карцова**

*Санкт-Петербургский государственный политехнический университет, ЦКП "Аналитическая спектрометрия" 195220 Санкт-Петербург, ул. Гжатская, 27, а/я 27 **Санкт-Петербургский государственный университет 198504 Санкт-Петербург, Петродворец, Университетский просп., 2 Поступила в редакцию 17.06.2009 г., после доработки 07.09.2010 г.

Предложена методика электрофоретического определения основных метаболитов триптофана, обладающих нейротоксичными свойствами (кинуренин, 3-гидроксикинуренин и кинуреновая кислота) с УФ-детектированием при 227 нм. Предел обнаружения при соотношении сигнал/шум = 3 составил 0.3 мкг/мл. В качестве биологических объектов исследованы особи Дрозофил. Возможность автоокисления 3-гидроксикинуренина в биологических объектах доказана методом масс-спектрометрии.

Ключевые слова: кинуренин, метаболиты триптофана, капиллярный электрофорез, масс-спектро-метрия.

В физиологических условиях более 95% триптофана в организме окисляется по кинурениновому пути, т.е. с промежуточным образованием кинуре-нина и 3-гидроксикинуренина до конечного продукта — никотинамидадениндинуклеотида (КЛБ+) (рис. 1). Нарушения такого пути метаболизма триптофана (КПМТ) происходят в организме в ответ на стресс, вызывающий образование свободных радикалов [1—4]. Увеличение концентрации кинуренина приводит к накоплению в организме 3-гидроксикинуренина — его метаболита с нейро-токсичными свойствами, являющегося основным генератором окислительного стресса [3—5]. Метаболиты триптофана (кинуренин, кинуреновая кислота, 3-гидроксикинуренин, хинолиновая кислота) (рис. 1) являются биомаркерами возрастных заболеваний: катаракты и глаукомы, урологических патологий, нарушений в работе центральной нервной системы, а также нейродегенеративных заболеваний, сопровождаемых потерей памяти [1, 3—8].

В хрусталике глаза кинуренины выполняют роль УФ-фильтров, защищая сетчатку и сам хрусталик от фотоиндуцированных повреждений [9]. Окисление 3-гидроксикинуренина приводит к образованию соединений, поглощающих свет в видимой области спектра, присутствие которых в хрусталике окрашивает белки в желтый цвет, что является одним из главных признаков развития катаракты.

Для своевременной диагностики заболеваний, выработки грамотной стратегии лекарственной терапии и возможности лечения без операционного вмешательства (например, в случае катаракты) необходим экспрессный вариант количественного определения продуктов метаболизма триптофана, в первую очередь, кинуренина и 3-гидроксикину-ренина, в биологических жидкостях [6—12].

Описаны хроматографические, флуориметриче-ские и масс-спектрометрические методы определения триптофана и его метаболитов в плазме крови, моче и слезной жидкости [1, 6—8, 10, 11].

В данной работе впервые представлены возможности одновременного определения триптофана, кинуренина, 3-гидроксикинуренина и кинуреновой кислоты в гомогенизате (ВгадарМа те1ап^аз1ег) методом капиллярного электрофореза с УФ-детектиро-ванием. Способность к самоокислению и димериза-ции 3-гидроксикинуренина исследована с использованием масс-спектрометрии.

Показано [7, 8, 13], что 90% триптофана в тканях насекомых и грызунов также метаболизирует по ки-нурениновому пути. Наиболее подходящим биологическим объектом для изучения модельных мутаций метаболизма триптофана являются плодовые мушки Дрозофилы. Их относительно короткая жизнь (~50 дней) позволяет фиксировать различные возрастные биохимические изменения (память, способ-

O

I I I

NAD+

Рис. 1. Пути метаболизма триптофана.

ность к обучению) [3, 14], что и проиллюстрировано нами в данной работе.

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ

Аппаратура. Электрофоретическое определение проводили с использованием системы капиллярного электрофореза "КАПЕЛЬ 105" (ООО "НПФ Люм-экс") со спектрофотометрическим детектором, для разделения использовали немодифицированный кварцевый капилляр общей длиной 60 см, эффективной длиной 50 см, внутренним диаметром 50 мкм.

Стабильность аналитов изучали на времяпролет-ном масс-спектрометре MALDI-TOF "Voyager DE" с лазерной десорбцией/ионизацией при помощи матрицы а-циано-4-гидроксикоричной кислоты. Условия МС-анализа: ускоряющее напряжение 15000 В, напряжение на сетке 95%, фокусирующее напряжение 0.25%, интенсивность лазера 2400 отн. ед.

Реагенты. Для приготовления буферного электролита и проведения пробоподготовки использовали тетраборат натрия (Sigma), ß-циклодекстрин (Sigma), конц. HCl (х. ч.), NaOH (х. ч.), NaCl (х. ч.), фосфатный буферный раствор (рН 8.0), бидистил-лят, полученный с помощью системы "Водолей".

Определяемые вещества: триптофан, кинуренин, 3-гидроксикинуренин, кинуреновая кислота (Sig-ma-Aldrich). Стандартные растворы (5 г/л) готовили

растворением точных навесок каждого аналита (5 мг) в 1 мл 50%-ного метанола в пробирках Эп-пендорфа и хранили при —20°С.

Биологический объект. Использовали плодовых мушек (Drosophila melanogaster) дикого типа canton S и мутантов: cardinal, cinnabar, vermilion, предоставленных Институтом физиологии им. Павлова (Санкт-Петербург).

Пробоподготовка биологического объекта. Каждая проба содержала 30 голов Дрозофил, которые гомогенизировали в 200 мкл фосфатно-солевого буферного раствора с рН 8.0 в течение 10 мин.

Приготовление раствора матрицы для масс-спек-трометрического анализа. Точную навеску р-циано-4-гидроксикоричной кислоты (10 мг) растворяли в специально приготовленном растворе (50%-ный раствор ацетонитрила в 0.1%-ном растворе три-фторуксусной кислоты), так чтобы конечная концентрация матрицы составила 10 г/л.

Условия нанесения образца на подложку. 0.5 мкл

матрицы и 0.5 мкл образца смешивали на подложке, высушивали на воздухе, затем проводили рекристаллизацию добавлением 1 мкл матрицы.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Для триптофана и его метаболитов были разработаны условия определения и разделения в режиме

ИССЛЕДОВАНИЕ КИНУРЕНИНОВОГО ПУТИ МЕТАБОЛИЗМА ТРИПТОФАНА

331

35 отн. ед.

н

св

о

т

с

5

6

-W

н

S

н е

£ н

S м

I

Я

О

св

т

О

4 о

5

м «

се <ч о

н е

£ н

S

8

t, мин

6

4

5

7

Рис. 2. Электрофореграмма модельной смеси триптофана, кинуренина, 3-гидроксикинуренина, кинуреновой кислоты (5 мг/л).

Прибор "Капель 105", 227 нм, ^внурр капилляра = 50 мкм.

Буферный электролит 5 мМ тетраборат натрия (рН 9.18), 3 мМ Р-циклодекстрин. Раствор пробы в бидистилляте. Ввод: 30 мбар, 20 с.

капиллярного зонного электрофореза. При оптимизации условий электрофоретического определения кинуренина, триптофана, 3-гидроксикинуре-нина и кинуреновой кислоты варьировали концентрацию (5—12 мМ) и рН (7—10) буферного раствора и концентрацию добавки р-циклодекстрин (0—20 мМ). При рН 9.18 буферного раствора компоненты находятся в анионной форме, при этом пики триптофана и кинуренина полностью не делятся. р-Циклодекстрин ф-ПД) за счет наличия гидрофобной полости образует комплексы включения с молекулами определяемых соединений, причем в большей степени с триптофаном, что приводит к полному разделению модельной смеси (рис. 2). В табл. 1 представлено разрешение (Rs) пар триптофан/кинуренин и кину-ренин/ 3-гидроксикинуренин. Наилучшее разделение достигнуто при введении в состав рабочего буферного электролита 3 мМ р-циклодекстрина.

Продолжительность анализа составила 8 мин, предел обнаружения при отношении сигнал/шум = = 3 равен 0.3 мкг/мл. Относительное стандартное отклонение аналитического сигнала триптофана, кинуренина и 3-гидроксикинуренина в течение дня для раствора с концентрацией 5 мкг/мл составляла ~0.03.

Определение 3-гидроксикинуренина, кинуренина и триптофана в реальном образце методом капиллярного электрофореза. Исследованы известные мутации Дрозофилы, блокирующие последовательные этапы КПМТ cardinal (с избыточным содержанием 3-гид-роксикинуренина), cinnabar (избыточное содержа-

ние кинуренина и кинуреновой кислоты), vermilion (избыточное содержание триптофана) и особи дикого типа, не подверженные мутации canton S.

Содержание 3-гидроксикинуренина оказалось в диапазоне от 0 до 560 нг/мг ткани в зависимости от мутации и половой принадлежности мух (рис. 3, табл. 2). Повышение концентрации 3-гидроксики-нуренина приводит к снижению способности к

Таблица 1. Зависимость разрешения (Rs) от концентрации в-ЦД в рабочем электролите (5 мМ тетраборат натрия, рН 9.18)

Концентрация в-ЦД, мМ Rs

Триптофан/ Кинуренин Кинуренин/ 3-ОН-кинуренин

0 0.7 ± 0.1 3.3 ± 0.2

3 1.8 ± 0.1 2.8 ± 0.1

5 О.. ± 0.1 2.5 ± 0.2

10 0.6 ± 0.3 2.3 ± 0.2

20 0 0.8 ± 0.1

Рис. 3. Электрофореграмма реального образца (гомогенизат голов самцов Дрозофил Cardinal). Прибор и условия те же. Раствор пробы в 5 мМ фосфатном буферном растворе (рН 8.0).

«

св

обучению и ухудшению памяти, что и обнаружено в лабораторных исследованиях [3, 5] для мутанта cardinal от 12-ого до 29-ого дня жизни.

Масс-спектрометрический анализ 3-гидроксики-нуренина. Имеются сведения [9, 12] о том, что образовавшийся 3-гидроксикинуренин далее может подвергаться окислению и димеризации с образованием ксантомматинов, оммохромовых (коричневых) пигментов сложных глаз насекомых.

Возможная димеризация 3-гидроксикинурени-на была независимо проверена на индивидуальном образце этого препарата при его хранении при комнатной температуре. Электрофоретический контроль показал, что на электрофореграмме исчезает пик 3-гидроксикинуренина, но при этом появляется сигнал другого соединения с меньшей электро-форетической подвижностью.

Получены масс-спектры образца сравнения 3-гидроксикинуренина и образца, который хранился при комнатной температуре в течение 2-х дней (рис. 4). Результаты показали, что пик молекулярного иона 3-гидроксикинуренина (224 m/z) со временем пропадает, однако появляется ряд сигналов в области 445—470 m/z, что соответствует молекулярной массе возможных продуктов его автоокисления и димеризации. Присутствующие на спектре сигналы 228, 229, 230, 231, 234 m/z (рис. 4) относятся к матрице — а-циано-4-гидроксикоричной кис

Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.

Показать целиком

Пoхожие научные работыпо теме «Химия»