научная статья по теме ИССЛЕДОВАНИЕ МЕХАНИЗМА АКТИВАЦИИ Р38 MAPK КАРДИОТОНИЧЕСКИМИ СТЕРОИДАМИ В КЛЕТКАХ ЭПИТЕЛИЯ ДИСТАЛЬНОГО ОТДЕЛА ПОЧЕЧНЫХ КАНАЛЬЦЕВ (УСКОРЕННАЯ ПУБЛИКАЦИЯ) Химия

Текст научной статьи на тему «ИССЛЕДОВАНИЕ МЕХАНИЗМА АКТИВАЦИИ Р38 MAPK КАРДИОТОНИЧЕСКИМИ СТЕРОИДАМИ В КЛЕТКАХ ЭПИТЕЛИЯ ДИСТАЛЬНОГО ОТДЕЛА ПОЧЕЧНЫХ КАНАЛЬЦЕВ (УСКОРЕННАЯ ПУБЛИКАЦИЯ)»

БИОХИМИЯ, 2010, том 75, вып. 8, с. 1070 - 1078

УДК 577.1

ИССЛЕДОВАНИЕ МЕХАНИЗМА АКТИВАЦИИ р38 MAPK КАРДИОТОНИЧЕСКИМИ СТЕРОИДАМИ В КЛЕТКАХ ЭПИТЕЛИЯ ДИСТАЛЬНОГО ОТДЕЛА ПОЧЕЧНЫХ КАНАЛЬЦЕВ*

© 2010 г. О.А. Акимова12 3**, О.Д. Лопина1, А.М. Рубцов1, П. Хамет3, С.Н. Орлов12 3

1 Биологический факультет Московского государственного университета им. М. В. Ломоносова, факс: (495)939-5022, электронная почта: ol_akimova@hotmail.com

2 НИИ общей патологии и патофизиологии Российской академии

медицинских наук, 125315 Москва, ул. Балтийская, 8

3 Научно-исследовательский центр Монреальского университета,

Канада

Поступила в редакцию 04.03.10 После доработки 09.04.10

Уабаин и другие кардиотонические стероиды (КТС) вызывают гибель клеток эпителия дистального отдела почечных канальцев (С7-МБСК) путем взаимодействия с №,К-АТРазой, но независимо от ингибирования ионных потоков, осуществляемых этим ферментом. Недавно было установлено, что гибель С7-МБСК клеток, обработанных уабаином, предотвращается при закислении цитоплазмы и ингибировании р38 МАРК, активация которой предшествует гибели клеток. В данной работе мы провели изучение механизма активации р38 МАРК кардиотоническими стероидами. Сравнение действия уабаина на фосфорилирование р38 МАРК и концентрацию внутриклеточного №+ и К+ в средах с различным содержанием К+, а также в присутствии №+-ионофора монензина и неселективного №+/К+ ионофора нигерицина показало, что активация р38 МАРК не связана с ингибированием ионных потоков, осуществляемых №,К-АТРазой, и увеличением соотношения [№+]1/[К+]1. Мы не обнаружили изменений в фосфорилировании р38 МАРК при снижении рН от 7,45 до 6,75. Фосфорилирование р38 МАРК, вызванное уабаином, не устранялось в присутствии ингибиторов протеинкиназ А, С и в и при ингибировании серин-треониновых фосфатаз окадоевой кислотой, оно не сопровождалось также активацией тирозиновых протеинкиназ. Полученные данные свидетельствуют о том, что активация р38 МАРК и его цитотоксическое действие не зависят от изменения внутриклеточных концентраций №+, К+ и Н+. Дальнейшие исследования должны установить природу посредников цитотоксического сигнального каскада, запускаемого КТС через конформационные перестройки №,К-АТРазы и приводящего к активации р38 МАРК.

КЛЮЧЕВЫЕ СЛОВА: №,К-АТРаза, уабаин, ионофоры, внутриклеточный №+ и К+, р38 МАРК, почки, клеточная смерть.

Na+, К+-активируемая, Mg2+-зависимая адено-зинтрифосфогидролаза (Na,K-ATPa3a) (КФ 3.6.1.3) осуществляет электрогенный обмен трех ионов внутриклеточного Na+ на два иона внеклеточного К+, используя для транспорта энергию, освобождающуюся при гидролизе ATP, и выполняя тем самым ключевую роль в регуляции внутриклеточной концентрации Na+ и К+, под-

Принятые сокращения: КТС — кардиотонические стероиды; [№+]; — внутриклеточная концентрация ионов [К+] — внутриклеточная концентрация ионов К; МАРК — митоген-активируемая протеинкиназа.

* Ускоренная публикация.

** Адресат для корреспонденции.

держании мембранного потенциала, объема клетки и сопряженного с Na+ транспорта аминокислот, глюкозы, нуклеотидов и других низкомолекулярных соединений [1—3]. В последнее время появилось большое количество работ, свидетельствующих о том, что Na, K-АТРаза является рецептором кардиотонических стероидов (КТС), которые помимо ингибирования Na+-насоса активируют сигнальные каскады, включая рецепторы инозитол-3-фосфата, высвобождение внутриклеточного Са2+, Ras, фос-фоинозитол-3 киназу (PI3K) и митоген-активи-руемую протеинкиназу (MAPK) Erkl/2, участвующие в регуляции экспрессии генов, пролиферации и смерти клеток [4—12]. Так, например,

уабаин — гидрофильный КТС, широко используемый в экспериментах in vitro, защищает клетки гладкой мускулатуры сосудов от развития программированной клеточной смерти (апопто-за), вызванной отсутствием ростовых факторов [13]. Это действие КТС связано с ингибировани-ем Na, K-АТРазы, увеличением [Na+]¡ и экспрессией Nal-чувствительных генов раннего ответа, таких как c-Fos и c-Jun, которые, в свою очередь, контролируют экспрессию антиапоптотических генов, включая морталин [14—16].

Следует особо отметить, что действие КТС на пролиферацию и смерть клеток тканеспеци-фично. Так, например, в отличие от гладкомы-шечных клеток, длительное воздействие уабаи-на запускает сигнальный каскад, приводящий к гибели эпителиальных клеток дистального отдела почечных канальцев собаки (клетки линии MDCK) [17—18]. Данный тип смерти имеет смешанные признаки некроза (набухание клеток) и апоптоза (активация каспазы-3) и классифицирован как «онкоз» — термин, происходящий от греческого «онкос» — набухание [19]. Следует отметить, что в отличие от действия уабаина ин-гибирование №,К-АТРазы в среде без калия не влияло на жизнеспособность MDCK клеток, но приводило к увеличению их чувствительности к цитотоксическому действию КТС [20—21]. На основании этого наблюдения мы предположили, что онкоз инициируется взаимодействием КТС с а-субъединицей №,К-АТРазы, но не является прямым следствием ингибирования ионных потоков, опосредованных этим ферментом, и возрастания внутриклеточного соотношения [Na+MK+L [6].

Используя фармакологический подход, мы не обнаружили участия Ras и PI3K в смерти MDCK клеток, вызванной уабаином. Негативные результаты были также получены при изучении действия уабаина на [Са2+]ь содержание активных форм кислорода и интернализацию ^^-АТРазы [22, 23]. При дальнейшем исследовании КТС-индуцированного сигнального каскада, мы установили, что развитию онкоза в C7-MDCK клетках, обработанных уабаином, предшествует резкое увеличение фосфорилиро-вания р38 МАРК [24]. Фосфорилирование этой формы стресс-активируемой MAPK было обнаружено и в других клетках, претерпевающих он-коз, тогда как в уабаин-устойчивых клетках содержание Р~р38 MAPK не изменялось. Смерть C7-MDCK клеток, вызванная уабаином, резко снижалась специфическим ингибитором р38 MAPK SB202190, но не зависела от присутствия его неактивного аналога SB202474, а также ингибиторов Erk и JNK MAPK [24]. Мы также обнаружили, что смерть С7-MDCK клеток пол-

ностью устраняется при уменьшении рН внутри клетки от 7,1 до 6,9 [25]. Эти данные свидетельствовали о том, что действие КТС как индукторов онкоза является следствием активации тка-неспецифического №+,К|-независимого рНгчув-ствительного сигнального каскада, опосредованного р38 МАРК. В настоящей работе мы продолжили изучение роли К+ и рН в фос-форилировании р38 МАРК, вызванном КТС, а также исследовали участие в этом сигнальном каскаде других протеинкиназ и фосфатаз.

МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Реактивы. Уабаин - ICN (Irvine, CA); 22NaCl, 86RbCl получены от «Amersham» (Mississauga, ON); монензин, валиномицин, нигерицин — «Sigma, St. Louis, МО» (США); Go 6983, Go 6976, Н-89 и окадоевая кислота — от «Calbiochem, San Diego, CA» (США). Антитела, специфичные к фосфорилированной форме р38 MAPK и фос-фотирозиновым остаткам были получены из «Cell Signaling» (Hornby, ON, Канада). Остальные реактивы были приобретены в «Sigma», «Gibco BRL» (Gaithersburg, MO, США) и «Anachemia» (Montreal, QC, Канада).

Культура клеток. Использовали эпителиальные клетки, полученные из почек собаки линии Madin-Darby (клетки линии C7-MDCK), функциональные характеристики которых соответствуют основным клеткам (principal cells) дис-тального отдела нефрона. Клетки рассаживали в 6-, 12- и 24-луночные плашки, а также в чашки Петри площадью 75 см2, помещали в инкубатор, содержащий 5%-ный СО2 (Fisher Scientific) и растили в модифицированной среде Дульбекко (DMEM), содержащей 5,5 мМ глюкозы, 10%-ную бычью сыворотку, 100 ед/мл пенициллина и 100 мкг/мл стрептомицина. Помимо DMEM эксперименты проводили в средах А, В и С. Среда А содержала (мМ): NaCl — 109,4; KCl — 5,4; CaCl2 — 1,8; MgSO4 — 0,8; NaHCO3 — 29,8; NaH2PO4 — 0,9; HEPES — 8,4; глюкоза — 5, а также витамины и аминокислоты в концентрациях, используемых в среде DMEM. Среды В и С были приготовлены аналогично среде А за исключением концентрации ионов Na+ и К+: [Na+]o = = 145,5 мM, [K+]o = 0,05 мM для среды В и [Na+]o = 30,7 мM, [K+]o = 114,8 мM для среды С. При изучении влияния рН на морфологию клеток и активацию р38 MAPK, вызванную уабаином, клетки инкубировали в контрольной (рН 7,45) и закисленной (рН 6,75) средах, содержащие (мМ): NaCl — 130; KCl — 5; CaCl2 — 1; MgCl2 — 1; NaH2PO4 — 0,9; HEPES — 20; глюкоза — 5, а также витамины и аминокислоты в концентрациях,

используемых в среде DMEM; рН доводили до значений 7,45 и 6,75 путем добавления Tris. По окончанию экспериментов морфологию клеток оценивали с помощью фазово-контрастного микроскопа (Nikon «Diaphot») без предварительного фиксирования клеток.

Содержание обмениваемого внутриклеточного Na+ и K+ измеряли по равновесному распределению 86Rb и 22Na, который устанавливается через 5 ч инкубации [20, 21]. С этой целью C7-MDCK клетки в 24-луночных плашках промывали фос-фат-содержащим физиологическим раствором (PBS, рН 7,4) после чего добавляли 1 мл среды, содержащих 0,5 мкКю/мл 86RbCl или 4 мкКю/мл 22NaCl, полный состав которых приведен выше. Через 5 ч инкубации при 37° клетки переносили на лед, промывали холодной средой, содержащей 100 мМ MgCl2 и 10 мМ HEPES, pH 7,4, и лизировали смесью 1%-ного додецилсульфат натрия (Ds-Na) и 4 мМ ЭДТА. Содержание внутриклеточного Na+ и K+ рассчитывали как A/am, где А — радиоактивность лизата (cpm), полученного из клеток, содержащих m мг белка, а — удельная радиоактивность среды инкубации (cpm/нмоль).

Вестерн блоттинг. По окончании эксперимента клетки лизировали в буфере следующего состава: 150 мМ NaCl, 1%-ный Triton X-100, 0,1%-ный Ds-Na, 2 мМ ЭДТА, 2 мМ ЭГТА, 25 мМ HEPES, pH 7,5, 10%-ный глицерин, 1 мМ NaF, 200 мкМ Na3VO4 и ингибиторы протеиназ (1 мкг/мл лейпептин, 1 мкг/мл апротинин и 1 мМ PMSF). После инкубации в течение 15 мин проводили центрифугирование при 20 000 g 10 мин. К полученным супернатантам добавляли буфер для образцов и выдерживали 5 мин при 95°. Разделение белков проводили в 4% концентрирующем и 10% разделяющем ПААГ по методу Леммли в присутствии Ds-Na. Затем осуществляли перенос белков на нитроцеллюлозную мембран

Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.

Показать целиком