МИКРОБИОЛОГИЯ, 2015, том 84, № 2, с. 184-191
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫЕ СТАТЬИ
УДК 582+539.1.047+575.826
ИССЛЕДОВАНИЕ МЕХАНИЗМОВ СТРЕССОУСТОЙЧИВОСТИ ГРИБОВ-ИНДИКАТОРОВ ВЫСОКИХ УРОВНЕЙ РАДИОАКТИВНОГО ЗАГРЯЗНЕНИЯ ЧЕРНОБЫЛЬСКОЙ ЗОНЫ
© 2015 г. А. С. Егорова*, Н. Н. Гесслер*, Л. П. Рязанова**, Т. В. Кулаковская**, Т. А. Белозерская*, ***, 1
*Институт биохимии им. А.Н. Баха Российской академии наук, Москва **Институт биохимии и физиологии микроорганизмов им. Г.К. Скрябина Российской академии наук, Пущино
***Биологический факультет МГУ им. М.В. Ломоносова Поступила в редакцию 24.07.2014 г.
Сравнение изменения уровня карбонильных групп в белках в ответ на пероксидный стресс выявило повышенную стрессоустойчивость у штаммов РигригевсИИит Шастит, выделенных из почв с высоким содержанием радионуклидов или ионов меди, по сравнению со штаммами из незагрязненных почв. Устойчивость к пероксидному стрессу у фоновых штаммов повышалась при увеличении содержания глюкозы в среде с 0.002 до 2%, тогда как у штаммов из загрязненных радионуклидами или ионами меди почв такой зависимости не наблюдалось. Проведено сравнение дыхательной активности и содержания полифосфатов у радиорезистентного штамма 1941 и штамма SM из зоны с фоновым уровнем радиоактивности. На протопластах штамма из Чернобыльской зоны (1941) выявлена повышенная дыхательная активность при росте на среде с низким содержанием глюкозы. Содержание неорганических полифосфатов (полиР) одинаково у обоих штаммов (1941 и SM) в контрольных условиях. При пероксидном стрессе снижение содержания неорганических полифосфатов отмечено только у фонового штамма SМ при росте на среде с низкой концентрацией глюкозы. Увеличение содержания полиР при регенерации Р. Шастит после пероксидного стресса наблюдается у обоих штаммов независимо от содержания глюкозы в среде.
Ключевые слова: РигригевсИИит Шастит, резистентность, окислительный стресс, дыхательная активность, полифосфаты.
DOI: 10.7868/S0026365615020032
Усиление антропогенного влияния на окружающую среду способствует формированию таких условий, с которыми многие микроорганизмы ранее не соприкасались. Микроскопические грибы обладают высоким потенциалом выживания в экстремальных условиях, устойчивы к загрязнению окружающей среды тяжелыми металлами, радионуклидами, нефтепродуктами и др. [1]. Отбору микроорганизмов, резистентных к нарастающему загрязнению окружающей среды, способствуют такие свойства отдельных групп грибов-экстремо-филов, как морфологическая изменчивость и отсутствие полового процесса.
Очень важными для процессов выживания в экстремальных условиях являются формирование защитных систем от стресса и способность к рациональному использованию энергетических ресурсов при росте на малодоступных источниках питания.
1 Автор для корреспонденции (e-mail: tabinbi@mail.ru).
Способность грибов сорбировать радионуклиды, транспортировать радиоактивные элементы внутрь клетки и переводить их в растворимую форму используется в биотехнологических процессах [2]. Они также являются перспективными моделями для понимания эволюции стрессоустой-чивости и выявления тенденций формирования паразитических микроорганизмов с новыми свойствами.
Неорганические полифосфаты (полиР) являются одним из факторов, вовлеченных в преодоление стресса у микроорганизмов [3, 4]. В частности, у грибов они играют важную роль в преодолении стрессов, вызванных токсическим воздействием катионов тяжелых металлов [5]. Представления о полиР как антистрессовых регуляторных соединениях заставляют обратить внимание на особенности метаболизма этих соединений у грибов, характеризующихся различной степенью устойчивости к стрессам.
Таблица 1. Штаммы Purpureocillium lilacinum, использованные в работе
Штамм Место и год выделения Радиоактивное загрязнение, Бк/кг Исследованные характеристики
Смоленский-SM Дерново-подзолистая почва, Смоленская обл., село Гнездово, 2004 г. Фоновый Устойчивость к окислительному стрессу, дыхательная активность, полиР
CP-09 Дерново-подзолистая почва, Московская обл., Воскресенский р-н, 2009 г. Фоновый Устойчивость к окислительному стрессу
146 Хутор Картамыш, Луганская обл. 2002 г. Фоновый; медь в почве >30 ПДК Устойчивость к окислительному стрессу
804 Черноземная почва, Донецкая обл., окрестности г. Константиновка Фоновый; тяжелые металлы Устойчивость к окислительному стрессу
1941 Почва Рыжего леса, зона отчуждения ЧАЭС, 1994 г. 5.9 х 105 Устойчивость к окислительному стрессу, дыхательная активность, полиР
1492 Почва Рыжего леса, зона отчуждения ЧАЭС, 1992 г. 2.7 х 105 Устойчивость к окислительному стрессу
744 Почва западного следа 10-км зоны ЧАЭС, 1992 г. 1.3 х 103 Устойчивость к окислительному стрессу
1786 Почва Рыжего леса, зона отчуждения ЧАЭС, 1993 г. 1.2 х 102 Устойчивость к окислительному стрессу
* Фоновый уровень радиоактивности соответствует плотности поверхностного загрязнения по 137С8 до 1 Ки/км2 (3.7 Бк/см2). Штаммы предоставлены кафедрой биологии почв факультета почвоведения МГУ и отделом микологии Института микробиологии НАН Украины.
В результате действия радиоактивного излучения на живые объекты повышается внутриклеточная концентрация кислородных радикалов [6]. В наших предыдущих работах выявлено, что при окислительном стрессе стабильные скорости роста лидирующих гиф микроскопических грибов Alternaría alternata, Cladosporium cladosporioides и Purpureocillium lilacinum из зоны отчуждения Чернобыльской АЭС (ЧАЭС) поддерживались при более высоких концентрациях H2O2 (до 10-2—101 М), чем у соответствующих штаммов из фоновых местообитаний (10-4—10-3 М). Кроме того, стратегия роста чернобыльских изолятов отличается от фоновых грибов [7, 8]. Для исследования механизмов устойчивости к окислительному стрессу из 3 родов рассмотренных ранее грибов нами был выбран род Puipureocillium.
Эвритопный вид Р. lilacinum (Thom) Luangsa-ard, Hou-braken, Hywel-Jones & Samson (2011) в последние годы используется как биоиндикатор высокой степени заражения радионуклидами почв Чернобыльской зоны — (3.7 х 106—3.7 х 108 Бк/кг) [2]. Кроме того, P. lilacinum широко распространен как в аэробных, так и в анаэробных условиях. Гриб способен паразитировать как на насекомых и рыбах, так и на людях; адаптируется к высокой концентрации меди в среде обитания.
В связи с приведенными особенностями вида целью работы было исследовать адаптацию штаммов Р. Шаетыт из почв, загрязненных и незагрязненных радионуклидами и ионами тяжелых металлов, к окислительному стрессу при культивировании на среде с разной концентрацией глюкозы (0.002, 0.2 и 2%). В качестве показателя окислительного стресса определяли количество карбонильных групп в белках как одого из общепринятых критериев окислительного стресса [9, 10]. Проводилось также сравнение других адаптивных метаболических перестроек — реакции дыхательной активности и содержания неорганических полиР в условиях стресса.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
Объект исследования. Объектами исследования служили 10 штаммов Р. Шаетыт из разных мест обитания: 6 штаммов выделены из почв с фоновым уровнем радиоактивности и 4 штамма из зоны отчуждения ЧАЭС с разным уровнем радиоактивного загрязнения (табл. 1). Среди штаммов из незагрязненных радионуклидами почв присутствуют два штамма (146 и 804), выделенные из почв с повышенным содержанием ионов меди.
Выращивание Р. Шаетыт проводили в модифицированной жидкой или на агаризованной среде Фогеля [11] (вместо сахарозы выращивание
проводили на глюкозе). Для опытов с определением карбонильных групп в белках и для определения полиР использовали чашки Петри с целлофановой подложкой. Мицелий P. lilacinum выращивали в течение 40 ч (конец логарифмической фазы роста) при 26° C на среде с концентрацией глюкозы 0.002, 0.2, и 2%. Для создания окислительного стресса 1 мл 10 мМ H2O2 помещали под целлофановый диск. После 1—2 ч экспозиции мицелий собирали и замораживали в жидком азоте.
Для определения дыхательной активности культуру выращивали в колбах Эрленмейера (750 мл) с жидкой средой Фогеля на качалке (150 об./мин) при 26°C в течение 42 ч. Инокулумом служила споровая суспензия (106 спор/колба).
Определение карбонильных групп в белках. Выращенный мицелий после обработки H2O2 (опыт) или H2O (контроль) замораживали и растирали в ступке с жидким азотом, затем суспендировали в десятикратном объеме буфера (50 мМ калий фосфат с 0.1% дигитонина, 1 мМ ЭДТА, 0.5 мМ фенил-метансульфонилфторида, pH 7.4) и после 10 мин инкубации центрифугировали при 7500 g в течение 20 мин. Концентрацию карбонильных групп в белках определяли спектрофотометрически с динит-рофенилгидразином по известной методике [12].
Опыты с 3,3'-диаминобензидином (ДАБ). Колонии штаммов P. lilacinum SM и 1941 засевали уколом и выращивали на агаризованной среде Фогеля, содержащей 0.2 или 2% глюкозы в течение 10 сут. Затем они были обработаны раствором 10 мМ калий-фосфатного буфера, рН 6.9, содержащим ДАБ (1 мг/мл) и пероксидазу хрена (0.3 мг/мл) [13]. Инкубировали в течение ночи. О количестве экзогенной H2O2 судили по интенсивности коричневой окраски на поверхности среды.
Измерение дыхательной активности штаммов проводили на препаратах протопластов [14]. Образовавшиеся при росте на качалке (26° C, 42 ч, 150 об./мин) пеллеты отфильтровывали через 3 слоя марли, промывали холодной дистиллированной водой, подсушивали фильтровальной бумагой и взвешивали. Их гомогенизировали в мягких условиях в предварительно охлажденном гомогенизаторе Поттера с холодным буфером (1.2 М сорбит, 10 мМ HEPES, 0.5% БСА, рН 7.5) в соотношении 1 : 5 (вес/об.) в течение 3 мин на льду. Протопласты отделяли от мицелия, пропуская го-могенат через два слоя капрона на стеклянной воронке. Выход протопластов контролировали при помощи светового микроскопа.
Потребление кислорода протопластами регистрировали in vitro в среде выделения при 25°С в ячейке с электродами, закрытыми фторопластовой пленкой. На ячейке поддерживали постоянную разность потенциалов 660 мВ. Для оценки KCN-чувствительного и KCN-резистентного дыхательных путей проводили анализ влияния ин-
гибиторов митохондриальной эл
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.