научная статья по теме ИССЛЕДОВАНИЕ МЕТАБОЛИЧЕСКИХ ПРЕВРАЩЕНИЙ ЖЕЛЕЗА И КОБАЛЬТА В КЛЕТКАХ БАКТЕРИИ AZOSPIRILLUM BRASILENSE SP7 МЕТОДОМ МЁССБАУЭРОВСКОЙ СПЕКТРОСКОПИИ Физика

Текст научной статьи на тему «ИССЛЕДОВАНИЕ МЕТАБОЛИЧЕСКИХ ПРЕВРАЩЕНИЙ ЖЕЛЕЗА И КОБАЛЬТА В КЛЕТКАХ БАКТЕРИИ AZOSPIRILLUM BRASILENSE SP7 МЕТОДОМ МЁССБАУЭРОВСКОЙ СПЕКТРОСКОПИИ»

ИЗВЕСТИЯ РАН. СЕРИЯ ФИЗИЧЕСКАЯ, 2015, том 79, № 8, с. 1165-1169

УДК 579.222.4+577.32+546.72+546.732

ИССЛЕДОВАНИЕ МЕТАБОЛИЧЕСКИХ ПРЕВРАЩЕНИЙ ЖЕЛЕЗА И КОБАЛЬТА В КЛЕТКАХ БАКТЕРИИ Azospirillum brasilense Sp7 МЕТОДОМ МЁССБАУЭРОВСКОЙ СПЕКТРОСКОПИИ

© 2015 г. А. А. Камнев1, А. В. Тугарова1, К. Ковач2, Э. Кузманн2, З. Хомоннаи2, Л. А. Куликов3, Ю. Д. Перфильев3

E-mail: aakamnev@ibppm.sgu.ru; a.a.kamnev@mail.ru

С использованием абсорбционного (на ядрах 57Fe) и эмиссионного (57Co) вариантов мёссбауэров-ской спектроскопии прослежены метаболические превращения 57FeIII/57FeI1 и 57Con в клетках бактерии Azospirillum brasilense Sp7 (спектры измерены при температуре 80 К). Для 57Con в течение часа наблюдались метаболические изменения в живых клетках. Для бактерий, выращенных на 57FeIn в качестве источника железа, наблюдались две компоненты высокоспинового 57Fen; параметры 57FeIn отвечали ферритиноподобным компонентам.

DOI: 10.7868/S036767651508013X

Абсорбционный (57Ре) вариант мёссбауэров-ской спектроскопии (АМС) давно и плодотворно используется для исследований состояния и превращений соединений железа в клетках различных микроорганизмов [1, 2]. С другой стороны, использование эмиссионной (57Со) мёссбауэров-ской спектроскопии (ЭМС) в биологии для аналогичного изучения состояния и превращений соединений кобальта, несмотря на значительно более высокую чувствительность эмиссионного варианта, ограничено единичными работами (см. обзор [3]).

Почвенные бактерии рода А108рт11ит, включая вид А. Ьга8Нвтв, уже более 35 лет привлекают пристальное внимание исследователей, в частности, в связи с их широкой распространенностью практически во всех климатических поясах и существенным агробиотехнологическим потенциалом, связанным, в первую очередь, с их фитостимулирую-щей активностью [4]. Бактерии вида А. ЬгазИвтв также представляют собой удобный модельный объект для исследований в области микробной экологии, поскольку данный вид включает штаммы, занимающие в ризосфере различные экологические ниши и по-разному реагирующие на внешние воздействия [5—7]. Тем не менее сведения о состоянии железа в клетках азоспирилл очень немногочисленны и разрозненны [8, 9]. В нашей недавней работе впервые для азоспирилл с

1 Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт биохимии и физиологии растений и микроорганизмов Российской академии наук, Саратов.

2 Институт химии, Университет им. Л. Этвеша, Будапешт, Венгрия.

3 Федеральное государственное бюджетное образовательное

учреждение высшего образования "Московский государ-

ственный университет имени М.В. Ломоносова", Москва.

помощью метода АМС были получены сведения о состоянии соединений железа для А. ЬгазИвтв (штамм 8р245) в живых клетках (после быстрого замораживания биомассы) [10], а также для лиофи-лизированной биомассы данного штамма при комнатной температуре [11]. Метод ЭМС был нами впервые использован для исследования структурной организации сайтов связывания катионов ме-таллофермента — глутаминсинтетазы из А. ЬгазИвтв 8р245, допированной ионами 57Со2+ [12, 13], а также связывания и трансформации кобальта(П) клетками данной бактерии [3, 5].

В настоящей работе проведено сравнительное исследование состояния и метаболической трансформации 57Реш/57Реп и 57Соп в клетках бактерии А. ЬгазИвтв (штамм 8р7, отличающийся по экологическому поведению от штамма 8р245 [5—7]) методом мёссбауэровской спектроскопии соответственно в абсорбционном и эмиссионном вариантах.

Культуру бактерий выращивали, как описано ранее [10, 11], при 31°С с аэрацией (в присутствии 0.5 г • л-1 МИ4С1 в качестве источника связанного азота) в течение 18 ч. Для исследований состояния железа методом АМС культуру бактерий выращивали в присутствии 7 • 10—5 М комплекса 57Реш с нитрилотриуксусной кислотой (57Реш—МТА; 4.0 мг • л-1 57Реш) в среде культивирования в качестве единственного источника железа; клетки отделяли от культуральной жидкости центрифугированием, трижды отмывали физраствором (0.85 мас. % №С1) и влажную суспензию быстро замораживали в жидком азоте.

Для измерения эмиссионных мессбауэровских спектров образцы культуры клеток, выращенной

Таблица 1. Мёссбауэровские параметры3, рассчитанные из эмиссионных спектров образцов биомассы клеток А10$рт11ит Ъгаяйете (штамм 8р7), выращенной в течение 18 ч, быстро замороженной в жидком азоте после добавления 57Со2+ и выдержки в течение 2 мин или 1 ч (замороженная суспензия), а также после высушивания указанных суспензий на воздухе (высушенная биомасса). Все измерения проведены при температуре 80 К (см. также рис. 1)

Образцы биомассы клеток (время контакта с 57Со2+) Спектральные компоненты (квадрупольные дублеты)8 8, мм • с 1 А, мм • с 1 Sr, %

Замороженная суспензия (2 мин) 1 2 1.10 0.89 2.59 2.00 56 19

Замороженная суспензия (1 ч) 1 2 1.16 1.02 2.84 2.18 35 31

Высушенная биомасса (2 мин) 1 2 1.18 1.12 2.79 1.84 55 10

Высушенная биомасса (1 ч) 1 2 1.14 1.07 2.93 2.25 43 23

а 5 — изомерный сдвиг (относительно a-Fe при комнатной температуре); А — квадрупольное расщепление; Sr — площадь спектральной компоненты (% от общей площади спектра).

б Квадрупольные дублеты, соответствующие дочерним формам 57FeI1, стабилизированным после ядерного превращения 57Co ^ 57Fe, с величинами экспериментально измеряемой полной ширины линии на половине интенсивности (W) в диапазоне 0.6—0.8 мм • с-1 (остаточные формы 57Feln, стабилизирующиеся в результате пост-эффектов, имели значения 5 ~ ~ 0.36-0.39 мм с-1, А ~ 0.7-1.0 мм • с-1; их значения Sr составляют 100% минус соответствующие значения Sr для дублетов 1 и 2). Расчетные ошибки: для 5 ± 0.02 мм • с-1; для А и Гэксп ± 0.05 мм • с-1; относительная ошибка для Sr, ±7%.

и отмытой от культуральной жидкости, как описано выше, выдерживали в течение 2 мин или 1 ч в присутствии 57Co2+ (объем 0.2 мл; плотность культуры 1.4 • 109 клеток/мл; 1.2 мКи 57CoCl2, что соответствует концентрации 1.2 • 10-5 M 57Co2+, малотоксичной для A. brasilense Sp7 [5, 14]) и затем быстро замораживали в жидком азоте. Измерения (при температуре 80 K) проводили как на замороженных суспензиях, так и на полученных из них высушиванием на воздухе в течение суток образцах.

Мёссбауэровские спектры в режиме пропускания измеряли, помещая замороженный образец в криостат с жидким азотом (температура измерения 80 K) [10], на спектрометре WISSEL (ФРГ), работающем в режиме постоянного ускорения, с источником 57Co(Rh). При измерении эмиссионных спектров источником у-излучения служили замороженные образцы, помещенные в криостат, с поглотителем (K4[57Fe(CN)6] • 3H2O) [7]. Полученные экспериментальные данные (в случае эмиссионных спектров конвертированные в форму, совместимую с абсорбционными спектрами) аппроксимировали методом наименьших квадратов с помощью программы MOSSWINN [15]; все значения изомерного сдвига приведены относительно a-Fe при комнатной температуре.

Сравнение мёссбауэровских параметров, рассчитанных для эмиссионных спектров биомассы клеток A. brasilense Sp7, контактировавших с

57Со2+ в течение 2 мин и 1 ч (табл. 1; на рис. 1 приведены для примера эмиссионные мёссбауэровские спектры сухих биомасс, измеренные при 80 К), показывает, что в клетках штамма 8р7 наблюдается присутствие двух форм нуклеогенного высокоспинового 57Реп, соответствующих исходным формам 57Соп. (Появление в эмиссионных спектрах дополнительного квадрупольного дублета, отвечающего алиовалентному 57Реш, соответствует пост-эффектам ядерного превращения 57Со ^ 57Бе [3, 5, 12].) В течение часа происходит метаболическая трансформация кобальта(П) как с некоторым изменением параметров, так и с перераспределением относительного количества обеих форм (см. табл. 1). Следует отметить, что хотя аналогичные изменения наблюдались в эмиссионных мёссбауэровских спектрах контактировавшего с ионами 57Со2+ штамма А. ЪгазИете 8р245 [5], параметры обеих форм 57Соп, наблюдавшихся в спектрах данных двух штаммов, заметно различаются, что отражает различия в их метаболических откликах на кобальт(11), также отмеченные ранее с помощью метода ИК-фурье-спектроскопии [5].

Для дублетов 2 в эмиссионных спектрах (см. рис. 1 и табл. 1), относительный вклад которых возрастает со временем контакта клеток с ионами 57Со2+, характерны меньшие значения изомерного сдвига (8 ~ 0.9—1.1 мм • с-1) и квадрупольного расщепления (А ~ 1.8-2.2 мм • с-1) по

сравнению с дублетами 1. Важно отметить, что указанные параметры эмиссионных спектров (которые соответствуют дочерним катионам 57FeI1, находящимся в координационном окружении исходных катионов 57CoI1) очень близки к значениям, полученным в абсорбционных мёссбауэров-ских измерениях для высокоспинового 57FeI1 в составе железо-серных белков, координируемого, помимо атомов S, также донорными атомами O/N (см. работу [16] и цитируемые в ней ссылки).

Так, для одного из четырех атомов Fe в кластере [4Fe—4S]2+ белка LytB, выделенного из супер-продуцирующей его бактерии E. coli, зарегистрированы параметры 8 = 0.89 мм • с-1 и А = 1.97 мм • с-1 при T = 77 K [16]. Это особенно примечательно в связи со следующими обстоятельствами. Как доказано в детальной работе [17] на примере E. coli, токсичность кобальта(П) для бактерий связана с участием катионов Co2+ в реакциях с лабильными кластерами [Fe-S] в процессе их биосинтеза de novo или репарации (также при участии специальных железосодержащих белков — доноров ионов железа, в которых Fe11 связано гораздо слабее, чем Fe111, и соответственно значительно более лабильно [1]). Таким образом, полученные в наших эмиссионных мёссбауэровских измерениях данные указывают на возможность участия ионов 57Co2+ в аналогичных реакциях с железо-серными белками азоспирилл на начальных этапах взаимодействия. Для прямого подтверждения этого, однако, потребуются дополнительные эксперименты.

Мёссбауэровское исследование процесса ассимиляции клетками A. brasilense Sp7 железа(Ш) из комплекса 57FeIII—NTA убедительно свидетельствует о частичном его восстановлении до желе-за(П). Линии последнего присутствуют в мёссбау-эровском спектре (рис. 2) в виде двух квадруполь-ных дублетов с раз

Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.

Показать целиком