= ЭКОЛОГИЯ =
УДК 57.083.18:591.434:597.585.4
ИССЛЕДОВАНИЕ МИКРОБИОМА КИШЕЧНИКА МАЛОЙ ГОЛОМЯНКИ
Comephorus dybowski Korotneff, 1904
© 2015 г. Н. Л. Белькова*, **, Н. Н. Деникина*, Е. В. Дзюба*
*Лимнологический институт СО РАН, 664033 Иркутск, Улан-Баторская, 3, а/я 278 **Иркутский государственный университет, 664000Иркутск, ул. К. Маркса, 1
E-mail: nlbelkova@gmail.com Поступила в редакцию 24.02.2015 г.
Впервые представлены данные метагеномного анализа микробного сообщества кишечника малой голомянки. Установлено, что бактериальное сообщество характеризуется значительным видовым разнообразием. В его составе выявлен 301 филотип (OTE), принадлежащий к 23 филам, из которых шесть кандидатные (Thermobaculum, Gracilibacteria, Candidatus Saccharibacteria, TM6, Latescibacte-ria, Parcubacteria). Показано, что видовое богатство, оцененное с помощью непараметрических критериев ACE и Chaol, составило 568 и 504 соответственно, видовое разнообразие по индексу Шеннона — 4.05. Анализ уникальных особенностей экологии и биологии малой голомянки позволяет объяснить некоторые из полученных данных по микробиому кишечника этого вида.
DOI: 10.7868/S0002332915050033
Деятельность микроорганизмов в составе микробных ассоциаций кишечника заключается в продуцировании ряда жизненно важных для организма-хозяина веществ и деструкции трудно-растворимых пищевых субстратов (Chen, Nunez, 2009; Jemielita et al., 2014 и др.). Использование методов высокопроизводительного секвенирова-ния позволило существенно расширить наше понимание участия микроорганизмов из различных симбиотических ассоциаций в онтогенезе позвоночных животных (McFall-Ngai, 2002; Cheesman et al., 2011), процессах развития заболеваний (Smith et al., 2012; Ridaura et al., 2013) и широком разнообразии физиологических функций, имеющих существенное значение для человека и животных (Chen Nunez, 2009; Gordon, 2012; Hooper et al., 2012; Nicholson et al., 2012 и др.). Известно, что в состав кишечных микробиоценозов животных (в частности, рыб) входят представители разных филогенетических групп (Roeselers et al., 2011; van Kessel et al., 2011; Sullam et al., 2012 и др.). Однако наряду с широко распространенными обнаруживаются и специфичные для рыб таксоны (Sullam et al., 2012; Wu et al., 2012; Ye et al., 2014 и др.).
Представители эндемичного семейства Come-phoridae (Comephorus baicalensis (Pallas, 1776) — большая голомянка, Comephorus dybowski Korotneff, 1904 — малая голомянка) — самые многочисленные виды рыб Байкала. При этом численность малой голомянки выше численности большой (Стариков, 1977). Они распространены по всей толще вод до глубин 1600 м (Талиев, 1955; Коряков, 1972; Сиделева, 1995). Для голомянок свой-
ственны пищевые суточные вертикальные миграции. Наиболее отчетливо они выражены у малой голомянки (Стариков, 1977). Основу кормовой базы этих видов составляют мезозоопланктон (Epischura Ъа1са1гт15), макрозоопланктон (Масго-Нес1оры8 ЪгатскИ) и ихтиопланктон (собственная молодь) (Талиев, 1955; Гурова, Пастухов, 1974; Стариков, 1977; Волерман, Конторин, 1983). В пище взрослых особей малой голомянки в течение всего года доминирует М. ЪгатскИ, что позволяет считать ее олигофагом (Дзюба, 2004).
Для изучения микробиомов кишечника байкальских рыб используются молекулярно-гене-тические методы (Белькова и др., 2008б; 2010). Показано разнообразие (Суханова и др., 2009; Дзюба и др., 2014) и выявлены специфичные генотипы (Белькова и др., 2008а; Суханова и др., 2011). Однако ранее в основном исследовали ло-сосевидных рыб (8а1шопо1ёе1). Генетическое разнообразие кишечных микробиомов эндемичных видов керчаковых рыб Байкала ранее не изучалось. Цель работы — исследование состава микро-биома кишечника малой голомянки.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
Сбор проб осуществляли разноглубинным тралом 22/108 с научно-исследовательского судна "Г.Ю. Верещагин" 01.06.2011 г. в районе зал. Провал. Для анализа использовали 5 взрослых самок общей длиной от 120 до 142 мм. Непосредственно после отлова в лабораторных условиях были взяты образцы кишечника рыб. Суммарную ДНК выделяли с применением коммерческого набора
ДНК-сорб В (ЦНИИ эпидемиологии Роспотреб-надзора, Москва) согласно протоколу производителя. Выделенную из всех образцов ДНК объединили и использовали в качестве матрицы в дальнейшем анализе.
Метагеномный анализ. Амплификацию фрагмента гена 16S рРНК, содержащего три вариабельных района V1-V3, проводили на эубактери-альных праймерах V1-9F и V3-541R (5'-X-AC-GAGTTTGATCMTGGCTCAG-3' и 5'-X-AC-WT-TACCGCGGCTGCTGG-3' соответственно, где X — 8-нуклеотидный бар-код, уникальный для каждого отдельного образца, за которым следует линкер AC (Chun et al., 2010)). Метагеномное се-квенирование ампликона 16S рДНК было проведено на реактивах и пиросеквенаторе 454 Genome Sequencer FLX Titanium (Roche) компанией ChunLab Inc. (Корея). Максимальная длина полученных последовательностей составила 488 нуклеотидов, химерные последовательности и последовательности короче 300 нуклеотидов были исключены из дальнейшего анализа. Результаты метагеномного секвенирования зарегистрированы в международной базе данных NCBI (№ PRJNA275510).
Анализ разнообразия и таксономического состава микробного сообщества. Каждая полученная в ходе метагеномного секвенирования последовательность была идентифицирована путем сравнения с данными, зарегистрированными в базе EzTaxon, с помощью алгоритма поиска BLASTN и попарного сравнения (Chun et al., 2007). Для идентификации применяли уровни сходства, %: >97 для вида, 94—97 для рода, 90—94 для семейства, 85—90 для порядка, 80—85 для класса, 75—80 для филы. Последовательности, имеющие сходство <75%, были охарактеризованы как неиден-тифицированные. Первичный анализ данных ме-тагеномного секвенирования, удаление коротких и химерных последовательностей, кластеризацию в ОТЕ (операционная таксономическая единица), оценку биоразнообразия путем расчета индексов ACE, Chao1 и Шеннона проводили с помощью программы Mothur v. 1.22.0 (http:// www.mothur.org). Выделение филотипов (OTЕ) проводили при кластерном расстоянии 0.03, оценку таксономической сложности сообщества — с помощью программы Rarefaction (Pyrosequenc-ing pipeline).
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
В кишечном микробиоме малой голомянки по результатам метагеномного секвенирования было выявлено 1214 последовательностей фрагментов гена 16S pРНК длиной >300 нуклеотидов, из них 1198 (98.68%) принадлежали к домену Bacteria, 16 (1.32%) — к домену Eukarya. Бактериальное сообщество характеризовалось значительным ви-
Представленность фил эубактерий в кишечном микробиоме малой голомянки
Таксон Доля в микробиоме, %
Proteobacteria 62.03
\krrucomicrobia 6.43
Teneri cutes 5.77
Actinobacteria 5.44
Acidobacteria 4.36
Firmicutes 3.13
Bacteroidetes 3.05
Chloroflexi 2.8
Planctomycetes 1.32
Lentisphaerae 0.58
Cyanobacteria 0.49
Gemmatimonadetes 0.41
Chlorobi 0.25
Nitrospirae 0.25
Fibrobacteres 0.16
Armatimonadetes 0.08
Spirochaetes 0.08
Кандидатные
Thermobaculum 0.66
TM6 0.49
Latescibacteria 0.33
Gracilibacteria 0.25
Candidatus Saccharibacteria 0.25
Parcubacteria 0.08
довым разнообразием. В его составе был выявлен 301 филотип (OTE), принадлежащий 23 филам, из которых 6 были кандидатными (таблица). Анализ а-разнообразия микробиома показал, что кривая накопления видов не выходит на плато, а число выявленных OTE увеличивается практически линейно, что свидетельствует о значительном видовом разнообразии микробиоты анализируемого образца (рис. 1). Видовое богатство по непараметрическим критериям ACE и Chaol составило 568 и 504, соответственно, а видовое разнообразие по индексу Шеннона — 4.05.
Число последовательностей
Рис. 1. Анализ a-разнообразия микробиома кишечника малой голомянки. ОТЕ — операционная таксономическая единица.
Метагеномный анализ микробиома кишечника малой голомянки позволил идентифицировать представителей нескольких крупных фил: Acido-bacteria, Actinobacteria, Bacteroidetes, Chloroflexi, Firmicutes, Planctomycetes, Proteobacteria, Teneri-cutes и Verrucomicrobia (таблица). Сравнение и сопоставление функциональных особенностей ближайших гомологов позволяет охарактеризовать последовательности микроорганизмов, входящих в состав микробиоты кишечника.
Самая крупная фила — Proteobacteria. Ее доля в суммарном микробном сообществе составляет 62.03%. При этом доминируют филотипы, относящиеся к роду Deefgea (40.2%) класса Betaproteo-bacteria (рис. 2). Физиологическое значение представителей этой группы остается неясным, однако вид Deefgea chitinilytica изолируют из раз-
личных водных объектов. Среди других представителей класса к автохтонным могут быть отнесены анаэробные бактерии рода Propionivibrio, а также виды семейства Neisseriaceae и рода Bordetella, в числе которых могут быть не только бактерии, в норме населяющие пищеварительную систему, но и потенциальные патогены рыб и водных организмов. Остальные представители этого класса составляют 7.33% общего разнообразия микробиома и являются типично водными бактериями с гетеротрофным или литогетеротрофным метаболизмом: Aquabacterium, Aquincola, Curvi-bacter, Gallionella, Hydrogenophaga, Ideonella, Inhella, Leptothrix, Limnohabitans, Methylibium, Polaromonas, Rhodoferax, Rubrivivax, Sideroxydans, Simplicispira, Sphaerotilus и Vogesella. При этом некоторые из них были изолированы или определены молекулярно-генетическими методами в водном микробном сообществе Байкала: Aquabacterium, Curvibacter, Hydrogenophaga, Limnohabitans, Polaromonas, Rhodoferax (Glöckner et al., 2000; Белькова и др., 2003; Zakharova et al., 2013). Класс Gammaproteobacteria немногочислен (6.51%), но в составе этой группы отмечены как классические представители автохтонного сообщества микроорганизмов кишечника рыб (Escherichia, Pseudomonas, Serratia, Steroidobacter), так и потенциальные патогены (Aeromonas, Aquicella, Haemophilus, Legionella, Coxiellaceae) и типично водные бактерии (Luteimonas, Methylosarcina, Methylo-bacter). Особый интерес вызывает класс Alphapro-teobacteria, доля которого составляет 4.2%, где доминируют бактери
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.