БИОФИЗИКА, 2015, том 60, вып. 4, с. 639-645
МОЛЕКУЛЯР НАЯ БИОФИЗИКА ==
УДК 577.325:577.15: 577.152.3
И ССЛЕДОВАНИЕ НАДМОЛЕКУЛЯРНОЙ О РГАНИЗАЦИИ ИНУЛИНАЗ ИЗ ПРОДУЦЕНТОВ РОДА Aspergillus С ПОМОЩЬЮ НЕКОТОРЫХ ЧИСЛЕННЫХ И ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫХ МЕТОДОВ
© 2015 г. М.Г. Холявка, В.Г. Артюхов, С.М. Макин
Воронежский государственный университет, 394006, Воронеж, Университетская пл., 1
E-mail: holyavka@rambler.ru
Поступила в p едакцию 21.01.15 г. После доработки 30.03.15 г.
Созданы компьютерные модели димера инулиназы из А^рег^Шш fkuum. Экспериментально исследована надмолекулярная организация инулиназы из А^рег^Шш niger. Обсуждается вопрос о роли различных форм инулиназ в проявлении их функциональной активности. Показано, что в процессе димеризации инулиназы при образовании контактов между мономерными формами фермента определяющая роль принадлежит неполярным аминокислотным остаткам.
Ключевые слова: инулиназа, димер, контактные области, структурно-функциональные свойства, надмолекулярная организация.
Инулиназы (инулазы, 2,1^-В-фруктан-фруктаногидролазы, КФ 3.2.1.7) участвуют в углеводном метаболизме высших растений и микроорганизмов, являются важнейшими компонентами сигнальных путей, играют важную роль в контролир овании пр оцессов клеточной дифференцировки и развития. Эти ферменты гидролизуют инулин и фруктоолигосахариды до фруктозы, разрушая гликозидные связи их молекул.
Для понимания механизма действия инули-наз in vivo необходимо исследовать их структурно-функциональные свойства, особенности молекулярной и надмолекулярной организации, поэтому работы, посвященные описанию молекулярных особенностей инулиназ в условиях различного микроокружения, имеют значительный теоретический и прикладной потенциал.
В литер атуре имеются пр отивор ечивые данные относительно надмолекулярной организации инулиназ. Это характер но не только для ферментов, полученных из различных видов одного рода (в качестве примера могут послужить роды Kluyveromyaes, AspergШus и Arthro-baoter), но даже для ферментов, выделенных из штаммов одного и того же вида микроорганизма. Одни автор ы утверждают, что инулиназа представлена только в мономерной форме, другие показывают наличие четвертичной структур ы в виде димера или даже тетр амера [1—8].
Целью нашей работы было изучение надмолекулярной организации инулиназ из проду-
центов рода Aspergillus расчетными и экспериментальными методами.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
Объектом исследования была инулиназа из Aspergillus niger. Ферментный препарат инулиназы из A. niger фирмы («Sigma aldrich», Германия) мы подвергали дополнительной очистке. Для р азр ушения димера и получения субъединиц фермента применяли раствор Na-ДДС в концентрации 3,5-10-5 моль/л [9].
В качестве субстр ата использовали инулин фирмы MP Biomedicals (Германия) из корней цикория с молекуляр ной массой 5000 Да. Со -держание белка определяли методом Лоури, каталитическую активность фермента - резорциновым методом, измеряя оптическую плотность при 540 нм на фотоэлектроколор иметре КФК-3 (Россия) [10]. За единицу каталитической активности инулиназы принимали такое количество фермента, которое катализирует образование 1 мкМ фруктозы за 1 мин.
Молекулярную массу фермента определяли при электрофорезе в ПААГ модифицированным методом Дэвиса [11]. По окончании электрофореза белковые полосы окрашивали нитратом серебра по методу М .В. Нестеренко [12].
Изображение поверхности молекулы инулиназы и ее субъединиц получали на сканирующем зондовом микроскопе SOLVER P47PRO («НТ-МДТ», Россия) в Лаборатории наноско-пии и нанотехнологии Центра коллективного
Таблица 1. Pазмеры, молекулярная масса и активность инулиназы и ее субъединиц из Aspergillus niger
Фракция Размеры, нм Молекулярная масса, кДа Удельная активность, ед./мг белка
R, нм* нм**
Нативная молекула 12,6 ± 2,4 6,4 ± 1,1 102 ± 4 34,7 ± 2,7
Субъединица 1 5,1 ± 1,1 3,4 ± 0,2 62 ± 3 29,8 ± 4,1
Субъединица 2 1,7 ± 0,4 2,2 ± 0,1 37 ±4 25,2 ±5,4
П римечание. * - Радиус молекулы, определенный методом динамического светорассеяния на приборе Photocor complex (ООО «Фотокор», Россия); ** - высота молекулы, определенная методом атомно-силовой микроскопии на приборе SOLVER P47PRO («НТ-МДТ», Россия).
пользования научным оборудованием Во ронеж-ского государственного университета.
Размеры инулиназы и ее субъединиц опр е-деляли методом динамического светорассеяния на приборе Photo^r сотр1ех (ООО «Фотокор», Россия) (X = 647 нм, гелий-неоновый лазер). Полученные данные обрабатывали в программе DynaLS.
Статистическую обработку результатов проводили с использованием t-критер ия Стью-дента при уровне значимости 5%.
Моделирование белковых комплексов осуществляли в программах Zdodc, ClusPro, GRAMM_X, HEX, SwarmDodk В качестве модели фермента, ставшей мишенью для докинга, в банке данных Protein Data Bank (PDB) нами была выбрана структура инулиназы из Aspergillus ficuum (код молекулы: 3SC7), которая была получена методом ^рентгеновской дифракции с разрешением 1,5 А [13]. Из структуры 3SC7 были предварительно удалены низкомолекулярные соединения.
PЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
Установлено, что инулиназа из A. niger образует гетеродимеры. Путем сочетания методов атомно-силовой микроскопии, динамического светорассеяния и электрофореза были определены размеры и молекулярные массы инулиназы и ее субъединиц (табл. 1). Наши результаты согласуются с данными литератур ы: р азмер молекулы инулиназы из A. awamori составлял 6,5 х 8,2 х 13,6 нм [14].
Далее мы попытались выявить роль про -цесса диссоциации молекулы фермента на субъединицы в проявлении функциональной активности инулиназ. Из табл. 1 видно, что активность инулиназы в димерной форме ниже, чем суммарная активность ее субъединиц. Вероятно, это связано с тем, что активные центры субъединиц белкового димера становятся стерически менее доступными для высокомолекулярного субстрата - инулина.
Для инулиназ из Aspergillus awamori BKMF-2250 и Arthrobacter sp. S37 также зафиксировано влияние процесса олигомеризации на способность фермента расщеплять инулин: мономерная форма белка обладала меньшей способностью к ферментативному катализу, чем ди-мер [4].
Опубликовано мало данных о структур ных особенностях инулиназы и родственных ей ферментов из группы гликозидгидролаз (GH32) [13-17]. В работе [16] на основе данных рент-геноструктур ного анализа была построена про -странственная модель инулиназы, выделенной из Aspergillus awamori. Авторы показали, что фермент состоит из двух доменов, которые объединены короткими полипептидными линкерами. Ориентация доменов стабилизируется многочисленными водородными и гидрофобными взаимодействиями [16].
В настоящее время широко обсуждается проблема пространственной организации ферментных систем. Вместе с тем отсутствуют исчерпывающие данные, касающиеся изучения фермент-ферментных взаимодействий, взаимосвязи физико-химических характеристик белков с их способностью образовывать надмолеку-ляр ные комплексы. К роме того, схемы надмо-лекуляр ной о рганизации компонентов метаболических систем требуют экспериментальных доказательств. По этой причине мы попытались создать компьютерные модели димеров инули-назы, выявив типы контактов между мономерными формами фермента. На рисунке представлена одна из полученных нами в программе Zdock моделей, расчетные линейные размеры которой были максимально приближены к данным динамического светорассеяния, представленным в табл. 1.
При использовании программ BioEdit и UGENE мы установили, что инулиназа из A. ficuum на 99% идентична по аминокислотной последовательности инулиназе из A. niger, поэтому экспериментальные данные, полученные для инулиназы из A. niger, корректно сравни-
П ространственные модели инулиназы: (а) - мономер, (б-г) - различные ракурсы димера.
вать с результатами р а счетов для инулиназы из A. ficuum.
В табл. 2 представлены аминокислотные остатки, входящие в со став контактных площадок при образовании димера инулиназы. Приведенные результаты представляют собой анализ расчетов по всем моделям, полученным в программах Zdcdc, ClusPro, GRAMM_X, HEX, SwarmDock. Численные показатели означают частоту встр ечаемо сти (в пр оцентах) аминокислотного остатка в контактной области соединения мономер ов ср еди всех моделей пр о -
грамм Zdock, ClusPro, GRAMM_X, HEX, Swar-mDock.
Из р асчетов следует, что количество неполярных и полярных незаряженных аминокислотных остатков, которые встречаются в составе контактных площадок пр и фор мир овании димера инулиназы, значительно выше (по 38,28% для каждой группы), чем количество о статков, заряженных отрицательно и положительно (14,19 и 9,25% соответственно). В процессе димеризации инулиназы ключевая роль, вероятно, принадлежит неполярным аминокислотным остаткам, что хорошо согласуется с
Таблица 2. Частота встречаемости (%) аминокислотного остатка в контактной области соединения мономеров среди всех моделей программ Zdcd^, ClusPro, GRAMM_X, HEX, SwarmDock
Аминокислотные остатки
Неполярные, % Полярные незаряженные, % Заряженные отрицательно, % Заряженные положительно, %
Ala64 - 1,96 Asn42 - 6,86 Asp27 - 4,9 Arg29 - 3,92
Ala84 - 1,96 Asn61 - 1,96 Asp37 - 2,94 Arg138 - 1,96
Ala91 - 2,94 Asn65 - 10,78 Asp79 - 1,96 Arg175 - 7,84
Ala117 - 11,76 Asn69 - 10,78 Asp92 - 0,98 Arg183 - 23,53
Ala 147 - 5,.88 Asn94 - 2,94 Asp106 - 1,96 Arg295 - 10,78
Ala206 - 6,86 Asn108 - 15,69 Asp115 - 7,84 Arg312 - 14,71
Ala257 - 5,88 Asn109 - 2,94 Asp 136 - 0,98 Arg313 - 1,96
Ala262 - 4,9 Asn118 - 5,88 Asp 144 - 5,88 Arg386 - 0,98
Ala281 - 0,98 Asn145 - 11,76 Asp 176 - 1,96 Arg393 - 0,98
Ala286 - 4,9 Asn155 - 1,96 Asp 198 - 9,8 Arg511 - 1,96
Ala308 - 17,65 Asn187 - 0,98 Asp207 - 4,9 His82 - 1,96
Ala371 - 1,96 Asn210 - 2,94 Asp216 - 1,96 His85 - 0,98
Ala395 - 0,98 Asn223 - 2,94 Asp228 - 13,73 His166 - 0,98
Ala400 - 1,96 Asn26 - 2,94 Asp275 - 1,96 His182 - 1,96
Ala425 - 0,98 Asn265 - 4,9 Asp282 - 2,94 His194 - 2,94
Ala442 - 1,96 Asn293 - 3,92 Asp285 - 4,9 His351 - 1,96
Ala449 - 1,96 Asn305 - 6,86 Asp296 - 0,98 His447 - 5,88
Gly51 - 9,8 Asn325 - 20,59 Asp310 - 19,61 Lys49
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.