ш
БИООРГАНИЧЕСКАЯ ХИМИЯ, 2012, том 38, № 2, с. 206-213
УДК 577.171.6.017:591.147.088
ИССЛЕДОВАНИЕ НЕОПИОИДНОЙ РЕЦЕПЦИИ р-ЭНДОРФИНА В ДОИМПЛАНТАЦИОННОМ РАЗВИТИИ ЭМБРИОНОВ МЫШИ in vitro
© 2012 г. А. С. Чернов*#, Г. А. Давыдова*, Ю. А. Ковалицкая**
*Учреждение РАН Институт теоретической и экспериментальной биофизики, 142290 Московская обл., г. Пущино, ул. Институтская, д. 3 **Филиал Учреждения РАН института биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова, Московская обл., г. Пущино Поступила в редакцию 20.06.2011 г. Принята к печати 11.07.2011 г.
Изучено действие Р-эндорфина на развитие 2-, 4-, и 8-клеточных эмбрионов мыши в условиях культивирования in vitro. Показано, что гормон не оказывал влияния на развитие 2-клеточных эмбрионов, но увеличивал жизнеспособность 4- и 8-клеточных эмбрионов. В присутствии Р-эндор-фина (0.1 мкМ) увеличивалось количество сформировавшихся бластоцист и уменьшалось количество аномально развитых бластоцист. С помощью флуоресцентной микроскопии изучено влияние гормона на изменение внутриклеточной концентрации ионов Са2+ у 2-, 4- и 8-клеточных эмбрионов мыши. Исследовано действие блокаторов активности аденилатциклазы и фосфолипазы С, а также блокатора опиоидных рецепторов налоксона, на изменение внутриклеточной концентрации ионов Са2+ у ранних эмбрионов мыши в присутствии Р-эндорфина. Установлено, что у мышиных эмбрионов на стадии двух бластомеров существуют как опиоидные, так и неопиоидные рецепторы гормона, тогда как на стадии 4 и 8 бластомеров локализованы только неопиоидные рецепторы Р-эндорфина. Показано, что действие Р-эндорфина на ранние эмбрионы мыши через неопиоидные рецепторы происходит при участии внутриклеточных ионов Са2+ и аденилатциклазной сигнальной системы.
Ключевые слова: ft-эндорфин, рецепция, аденилатциклаза, доимплантационные эмбрионы мыши.
ВВЕДЕНИЕ
В 1980 г. Джулиард и сотр. обнаружили, что фрагмент тяжелой цепи IgG 364—377 подобен центральной части молекулы Р-эндорфина [1]. Хоук и сотр. синтезировали этот фрагмент (SLT-CLVKGFYPSDI) и показали, что он конкурирует с 1251-меченным Р-эндорфином за связывание с мембранами головного мозга крысы [2]. В это же время Хазум и сотр. было установлено существование неопиоидных, нечувствительных к специфическому опиоидному блокатору налоксону, рецепторов Р-эндорфина [3].
В лаборатории пептидных биорегуляторов ФИБХ был синтезирован декапептид SLT-CLVKGFY (авторское название пептида — имму-норфин), соответствующий последовательности
Сокращения: [Ca2+] — внутриклеточная концентрация ионов Ca2+; IGF — insulin-like growth factor (инсулинопо-добный фактор роста); LIF — leukaemia inhibitory factor (лейкемия-ингибирующий фактор); EGF — epidermal growth factor (эпидермальный фактор роста); PDGF — platelet derived growth factor (тромбоцитпроизводный фактор роста); TGF — transforming growth factor (трансформирующий фактор роста); FGF — fibroblast growth factor (фактор роста фибробластов); PMCA — plasma membrane Ca2+-ATP-ase (кальциевая АТР-аза плазмалеммы). # Автор для связи: +7 (4967) 73-94-91; факс: +7 (4967) 33-05-53; эл. почта: c.h.e.r.n.o.v@rambler.ru.
364—373 H-цепи IgG человека, и установлено, что он ингибирует связывание 125Ьмеченного Р-эн-дорфина с перитонеальными макрофагами мыши (Ki 5.9 нМ) [4] и Т-лимфоцитами крови человека (Ki 0.6 нМ) [5]. Изучение специфичности общих для Р-эндорфина и иммунорфина сайтов связывания показало, что эти сайты не принадлежат рецепторам, чувствительным к природным опио-идным пептидам — [Met5] - и ^си5]энкефалину, а также к антагонисту опиоидных рецепторов на-локсону, т.е. что рецепторы, связывающиеся с Р-эндорфином и иммунорфином, не являются опиоидными. Кроме того, было показано, что Р-эндорфинподобный пептид иммунорфин и его фрагмент 6-10-пентарфин (VKGFY), оказывают стимулирующее действие на раннее развитие эмбрионов мыши in vitro [6, 7]. Полученные данные позволяют предположить наличие неопиоидных рецепторов гормона на ранних стадиях доим-плантационного развития эмбрионов мыши. В репродуктивной системе млекопитающих показано наличие опиоидного нейропептида Р-эндор-фина и ц-опиоидных рецепторов [8, 9]. Однако роль гормона в этой системе до настоящего времени не установлена.
Цель настоящей работы изучить влияние Р-эндорфина на раннее развитие эмбрионов мы-
ши и установить возможные механизмы действия гормона.
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
Эмбриональное развитие млекопитающих — это многоступенчатый сложный процесс превращений и перестроек, в результате которых из зиготы развивается взрослый организм. Во время развития эмбриона млекопитающих происходят сложные взаимодействия как между эмбрионом и материнским организмом, так и между клетками самого эмбриона. В настоящее время изучению фундаментальных основ эмбриогенеза животных и человека, а также исследованию факторов, влияющих на этот процесс, уделяется огромное внимание во всем мире. Известно, что на доимплан-тационное развитие эмбрионов млекопитающих оказывают влияние несколько семейств ростовых факторов различного происхождения, такие как IGF, EGF, PDGF, также TGF-р, FGF и LIF [10]. Кроме того показано, что сами эмбрионы способны продуцировать многие ростовые факторы [11, 12], но механизмы их действия до сих пор мало изучены. Некоторые из них, такие как TGF-a и EGF, стимулируют развитие эмбрионов in vitro [13], другие же не имеют выраженного эффекта. Установлена определяющая роль факторов роста и их рецепторов в процессе дробления клеток раннего эмбриона и образования бластоцист [10, 14-16].
Однако, помимо классических факторов роста, существуют неспецифические пептидные ростовые факторы, которые также могут оказывать влияние на ранний эмбриогенез млекопитающих. Можно предположить, что одним из факторов, который, также как и ростовые факторы, способен оказывать влияние на развитие эмбрионов in vivo, является Р-эндорфин.
Согласно литературным источникам, концентрация Р-эндорфина в репродуктивной системе лежит в диапазоне от 0.001 до 0.1 мкМ [8, 17]. Гормон секретируется фолликулярными клетками, окружающими яйцеклетку, и регулирует созревание и овуляцию ооцитов [18]. Под действием эст-радиола увеличивается продукция Р-эндорфина в тканях яйцевода [19]. Плацента способна секрети-ровать проопиомеланокортин - предшественник Р-эндорфина [20], а клетки эндометрия секретиру-ют Р-эндорфин во время имплантации зародыша в стенку матки [21]. Основные исследования по действию Р-эндорфина на пролиферацию и диффе-ренцировку клеток млекопитающих in vitro проведены на культурах клеток, постимплантационных эмбрионах и взрослых животных [22-25]. Данные, свидетельствующие о его действии на ранние эмбрионы млекопитающих, отсутствуют.
Основными стадиями раннего развития, определяющими дальнейшее формирование и развитие всего организма, считаются 2-, 4- и 8-клеточ-ная, поэтому мы исследовали влияние гормона на развитие 2-, 4- и 8-клеточных эмбрионов мыши in vitro и возможные механизмы его действия. Эксперименты показали, что внесение в среду культивирования Р-эндорфина в концентрации 0.1 мкМ оказывает стимулирующее действие на развитие 4- и 8-клеточных эмбрионов мыши in vitro (таблица). При добавлении гормона происходит ускорение процесса делений дробления, эмбрионы быстрее проходят все стадии доимплантационно-го развития, увеличивается количество сформировавшихся бластоцист, конечной стадии доим-плантационного развития. Кроме того, важным критерием оценки качества бластоцист является "выклевывание": разрыв оболочки оплодотворения и выход зрелой бластоцисты. Этот процесс свидетельствует о полном прохождении эмбрионом доимплантационного развития и готовности к последующей имплантации.
Количество сформировавшихся бластоцист из 2-клеточных эмбрионов при культивировании в присутствии Р-эндорфина было на уровне контроля и не имело достоверных различий (таблица). Причиной такого эффекта может быть, во-первых, наличие на 2-клеточных эмбрионах как опиоидных, так и неопиоидных рецепторов, а во-вторых, возможное взаимодействие рецепторов между собой. Взаимодействуя друг с другом на уровне передачи сигнала, рецепторы одного типа (например, опиоидные) могут ингибировать передачу сигнала через рецепторы другого типа (не-опиоидные). В литературе данный эффект принято называть "crosstalk" [36]. В свою очередь, это взаимодействие может приводить либо к угнетению развития эмбрионов, либо вовсе не влиять на их развитие. Это предположение подтверждают данные о действии гормона на ооциты. Показано, что Р-эндорфин при внесении в среду культивирования значительно уменьшал скорость созревания ооцитов коровы, однако, добавление опио-идного антагониста налоксона блокировало угнетающее действие гормона [26]. Известно, что ранние эмбрионы мыши чувствительны к агони-стам и антагонистам опиоидных рецепторов [27], что позволяет предположить наличие на их поверхности опиоидных рецепторов.
Калюжным и соавт. с помощью иммуноцито-химического метода показано, что опиоидные рецепторы локализованы только на самых ранних стадиях (зигота, ранняя 2-клеточная), и на более поздних стадиях (бластоциста и ее выход из оболочки оплодотворения). В период с 4-клеточной стадии и до морулы, опиоидные рецепторы отсутствуют [28]. Интересно отметить, что на стадии двух клеток происходит активация собственного генома эмбриона, знаменующая переход от мате-
Влияние Р-эндорфина на формирование бластоцист доимплантационными эмбрионами мыши в условиях in vitro
Стадия раз- Воздействие^ Общее число эмбрионов Общее количество сформировавшихся бластоцист Бластоцисты, выходящие из zona pellucida Аномально развитые бластоцисты
вития число % от числа эмбрионов число % от общего числа бластоцит число % от общего числа бластоцит
2-клеточные Контроль 29 19 65 4 14 2 7
ß-Эндорфин 36 28 77 5 14 3 8
ß-Эндорфин + + налоксон 34 27 80* 7 20* 2 5
4-клеточные Контроль 31 21 69 4 13 2 6
ß-Эндорфин 36 29 81* 5 14 2 6
ß-Эндорфин + + налоксон 34 27 81* 5 15 2 6
8-клеточные Контроль 36 27 76 9 27 3 9
ß-Эндорфин 37 31 84* 14 39* 1 3
ß-Эндорфин + + налоксон 33 29 88* 8 25 2 5
$ Концентраци
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.