научная статья по теме ИССЛЕДОВАНИЕ ОДНОСЛОЙНЫХ ВЕЗИКУЛ ДИМИРИСТОИЛФОСФАТИДИЛХОЛИНА В ВОДНЫХ РАСТВОРАХ САХАРОЗЫ МЕТОДАМИ МАЛОУГЛОВОГО РАССЕЯНИЯ НЕЙТРОНОВ И РЕНТГЕНОВСКИХ ЛУЧЕЙ Химия

Текст научной статьи на тему «ИССЛЕДОВАНИЕ ОДНОСЛОЙНЫХ ВЕЗИКУЛ ДИМИРИСТОИЛФОСФАТИДИЛХОЛИНА В ВОДНЫХ РАСТВОРАХ САХАРОЗЫ МЕТОДАМИ МАЛОУГЛОВОГО РАССЕЯНИЯ НЕЙТРОНОВ И РЕНТГЕНОВСКИХ ЛУЧЕЙ»

КРИСТАЛЛОГРАФИЯ, 2015, том 60, № 1, с. 144-149

ПОВЕРХНОСТЬ, ТОНКИЕ ПЛЕНКИ

УДК 577.352.3

ИССЛЕДОВАНИЕ ОДНОСЛОЙНЫХ ВЕЗИКУЛ ДИМИРИСТОИЛФОСФАТИДИЛХОЛИНА В ВОДНЫХ РАСТВОРАХ САХАРОЗЫ МЕТОДАМИ МАЛОУГЛОВОГО РАССЕЯНИЯ НЕЙТРОНОВ

И РЕНТГЕНОВСКИХ ЛУЧЕЙ © 2015 г. М. А. Киселев1, Е. В. Земляная1, Е. И. Жабицкая12, В. Л. Аксенов1,3

1 Объединенный институт ядерных исследований, Дубна E-mail: elena@jinr.ru 2Международный университет "Дубна", Дубна 3 Петербургский институт ядерной физики, Гатчина Поступила в редакцию 12.05.2014 г.

Методами малоуглового рассеяния нейтронов и малоуглового рассеяния рентгеновского синхро-тронного излучения проведено исследование полидисперсной популяции везикул димиристоил-фосфатидилхолина в водном растворе сахарозы. Расчеты на основе единого подхода, определяемого методом разделенных формфакторов, показали, что увеличение концентрации сахарозы существенно влияет на структуру везикулярной системы.

DOI: 10.7868/S0023476115010117

ВВЕДЕНИЕ

Развитие рынка нанолекарств и их переносчиков требует развития адекватных методов их диагностики, в том числе методов исследования везикулярных систем из фосфолипидов, используемых как транспортные лекарственные системы. Другим фактором, определяющим интерес исследователей к данному направлению, является возможность получения новой информации о биологических мембранах путем исследования фос-фолипидных однослойных везикул.

Основными экспериментальными методами исследования везикулярных систем являются малоугловое рассеяние нейтронов (МУРН) с длинами волн от 0.1 до 1 нм и рассеяние рентгеновского синхротронного излучения с длиной волны фотона от 0.1 до 0.2 нм, позволяющие определять размеры, форму и внутреннюю структуру бислоя везикул. Поэтому широкомасштабные малоугловые исследования липидных везикул ведутся рядом российских и зарубежных научных групп.

Эффективным методом анализа данных по МУРН для получения информации о везикулярных системах в избытке воды является метод разделенных форм-факторов (РФФ) [1, 2]. В совокупности с гидрофобно-гидрофильной (ГГ) моделью описания плотности длины рассеяния метод РФФ успешно применен для анализа результатов эксперимента по МУРН на везикулах димиристоилфосфатидилхолина (ДМФХ) при разной температуре, а также для исследования многокомпонентных везикулярных систем на ос-

нове церамида 6, моделирующих верхний слой кожи млекопитающих (Stratum Corneum) [3—5].

Применение данного подхода в случае малоуглового рентгеновского рассеяния (МУРР) приводит к определенным трудностям, связанным с тем, что МУРР "видит" бислой более контрастно, следовательно, требуются более сложные по сравнению с ГГ-моделью формы для описания функций распределения плотности длины рассеяния поперек бислоя. Вторым важным аспектом метода МУРР является меньший некогерентный фон и, как следствие, возможность измерять большие значения векторов рассеяния. Это увеличивает пространственное разрешение эксперимента. Оба фактора приводят к росту числа параметров модели, подгоняемых к экспериментальным данным, что усложняет процесс минимизации соответствующих функционалов. К эффективным методам глобальной минимизации относится алгоритм асинхронной дифференциальной эволюции (АДЭ) [6—8]. Этот алгоритм был успешно применен в [9] для анализа спектров МУРР на основе РФФ-метода, обобщенного для учета флук-туаций толщины бислоя.

Дисахариды стабилизируют липидный бислой. Везикулы, приготовленные в водных растворах дисахаридов, полностью сохраняют свои свойства после лиофилизации и последующей гидратации. Это свойство дисахаридов (мальтозы) используется при изготовлении фосфолипидной транспортной наносистемы, применяемой как контейнер для лекарств. Такие нанолекарства разрабатываются в Институте биомедицинской

химии (Москва). В экспериментах на однослойных везикулах методом МУРН контраст (разность в плотности длины рассеяния между ли-пидным бислоем и водой) увеличивается за счет использования тяжелой воды. Исследования влияния D2O по сравнению с Н20 на структуру и свойства липидного бислоя показали, что во многих случаях замена Н20 на D20 не является существенной [2]. Увеличение контраста в экспериментах на синхротронных источниках в рентгеновском диапазоне длин волн является нетривиальной задачей при исследовании биологических объектов. В [10—12] показано, что дисахариды (сахароза и мальтоза) существенно (в десятки раз) увеличивают контраст в экспериментах методом МУРР на однослойных везикулах фосфолипидов. При этом вопрос о влиянии дисахарида на структуру липидного бислоя остался открытым.

Цель настоящей работы — исследование структуры полидисперсной популяции однослойных везикул ДМФХ в растворе сахарозы в зависимости от его концентрации. Анализ спектров МУРН и МУРР проведен на единой модельной основе, определяемой РФФ-методом, модифицированным для учета флуктуации бислоя.

В работе описаны детали приготовления образцов и проведения экспериментов, изложен РРФ-метод и обсуждаются его особенности применительно к МУРР, представлены результаты анализа спектров МУРН и МУРР.

ЭКСПЕРИМЕНТ, ПРИГОТОВЛЕНИЕ ОБРАЗЦОВ

Измерения спектров МУРН проводились на малоугловом спектрометре ЮМО импульсного реактора ИБР-2 (ЛНФ ОИЯИ, Дубна) при двух положениях детектора, соответствующих расстоянию образец—детектор 13.17 и 4.38 м. Спектры измерялись при температуре образца 30°С. Многослойные везикулы ДМФХ приготавливались путем растворения 1% по массе ДМФХ в водном (D2O) растворе сахарозы. Массовая концентрация сахарозы в D2O выбиралась как 0, 5, 10, 20%. Образец гомогенизировался путем нагревания и охлаждения выше и ниже температуры главного фазового перехода ДМФХ (23°C). Однослойные везикулы (ДМФХ) изготавливались путем многократной экструзии раствора многослойных везикул через поликарбонатные фильтры с диаметром пор 500 Ä на приборе LiposoFast Basic extruder (Avestin, Ottawa, Canada) [13].

Измерения спектров МУРР проводились на установке А2 синхротронного источника Doris III (DESY, Германия) при двух положениях детектора, соответствующих расстоянию образец-детектор 1 и 3 м. Спектры измерялись при температуре образца 30°С. Аналогично нейтронным экспери-

ментам однослойные везикулы ДМФХ изготавливались экструзией 15 мМ (1% по массе) суспензии многослойных везикул ДМФХ в водном растворе сахарозы с концентрацией 40% через фильтры с порами диаметра 500 А.

РФФ-МОДЕЛЬ С УЧЕТОМ ФЛУКТУАЦИИ ТОЛЩИНЫ БИСЛОЯ

Для определения размера и установления внутренней структуры везикул использовался Рфф-метод, разработанный для анализа данных МУРН на однослойных везикулах [1, 2] и обобщенный для учета флуктуации толщины бислоя [9]. В отличие от других известных подходов (например, оболочечная модель [14], приближение Гинье [15]), метод РФФ позволяет использовать любую подходящую функцию для описания распределения плотности р(х) длины рассеяния нейтронов в направлении нормали к мембране.

Основные формулы, определяющие РФФ-метод. Макроскопическое сечение монодисперсной популяции везикул определяется формулой [15]:

^ (я) = пВ(д, Я)Вь(д,рЩд) (1)

иЫтап

где q — вектор длины рассеяния, S(q) ~ 1 — структурный фактор в форме Дебая [16], п — число везикул на единицу объема, Fs и Fb — соответственно формфактор бесконечно тонкой сферической оболочки радиуса R и формфактор бислоя:

R1

\2

Fs(q, R) = | 4пqRsin(qR)J ,

л2

Fb(q, р) =

d/2

J р(х, 0b)cos(qx)dx

V -d/2

(2)

Здесь 9ь — совокупность параметров, определяющих толщину различных участков бислоя. С учетом полидисперсности везикулярной системы, описываемой распределением Шульца

G(R,{ R)) = R m!

/ \ m+1

т +1

exp

(т + 1)R

" R J

(3)

где (К) — средний радиус везикулы, m — коэффициент полидисперсности, макроскопическое сечение dL(q)/dQ. полидисперсной популяции везикул имеет вид

dL dQ

R max

J F s(q, R)G(R,(R))dR

(q) = n

R min

R max

J G(R,( R))dR

R min

-Fb,

(4)

146

КИСЕЛЕВ и др.

где пределы интегрирования Д ственно равны 100 и 1000 А

и Д

Ш1П "шах

соответ-

Шфь), кР) =

При анализе спектров МУРН обычно полагают

Ръ = , пренебрегая флуктуациями параметров бислоя. Что касается МУРР, лучшее пространственное разрешение в синхротронном эксперименте требует для описания экспериментальных спектров учета флуктуаций параметров липидно-го бислоя [9]. Аналогичная ситуация возникала при описании рефлектометрической кривой от липидных монослоев на поверхности воды [17]. В отличие от данных рефлектометрии, полученных на рентгеновских трубках, описание рефлек-тометрической кривой, измеренной на синхро-тронных источниках, потребовало перехода от ступенчатых функций, описывающих плотность распределения электронов в липидном бислое, к гауссовым функциям, моделирующим положение отдельных молекулярных групп фосфолипида. Такой подход предполагает, что положения молекулярных групп молекулы фосфолипида флуктуируют относительно некоторого среднего. Следовательно, параметры липидного бислоя (толщина, толщина гидрофобной и гидрофильной его части) могут быть аппроксимированы нормальными распределениями. Таким образом, разработанный в [17] подход для описания рефлектомет-рической кривой от липидного монослоя на поверхности воды и разработанный в [9] метод для описания кривой МУРР от однослойных везикул фосфолипида обеспечивают, хотя и на разной модельной основе, возможность учета флуктуаций параметров липидных слоев при анализе соответствующих экспериментальных данных.

Для описания флуктуации параметров липид-ного бислоя (толщина липидного бислоя, толщина гидрофобной части бислоя и т.п.) будем использовать стандартное нормальное распределе-

_-к_'

I

Здесь (9Ь) — совокупность параметров, определяющих средние значения параметров плотности длины рассеяния р(х, 9Ь), кр - коэффициент полидисперсности (флуктуации). Расчеты проводились с К = 3. Отметим, что в случае к£ = 0 под интегралом в формуле (5) значения параметров, определяющих внутреннюю структуру бислоя,

равны средним 9Ь = (9Ь) и Д = .

Далее макроскопическое сечение корректируется с учетом некогерентного фона 1В и разрешения спектрометра [18] и принимает вид

I(д) = *к(д) + 1 А2 *-г йО 2 ¿д2

^

Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.

Показать целиком

Пoхожие научные работыпо теме «Химия»