ПРИКЛАДНАЯ БИОХИМИЯ И МИКРОБИОЛОГИЯ, 2014, том 50, № 2, с. 203-210
УДК 579.222+612.017.1
ИССЛЕДОВАНИЕ ПОВЕРХНОСТНЫХ АНТИГЕННЫХ ЭПИТОПОВ Yersinia pseudotuberculosis C ПОМОЩЬЮ МОНОКЛОНАЛЬНЫХ АНТИТЕЛ
© 2014 г. А. А. Бывалов* **, Л. Г. Дудина* **, С. Г. Литвинец**, О. Д. Новикова***, В. А. Хоменко***, О. Ю. Портнягина***, Ю. С. Оводов*
*Институт физиологии Коми НЦ УрО РАН, Сыктывкар, 167982
**Вятский государственный университет, Киров, 610000 ***Тихоокеанский институт биоорганической химии ДВО РАН им. Г.Б. Елякова, Владивосток, 690022 e mail: byvalov@nextmail.ru Поступила в редакцию 6.05.2013 г.
С помощью набора моноклональных антител проведена оценка влияния внешних воздействий на иммунохимическую активность бактерий Yersinia pseudotuberculosis и выделенных из них препаратов липополисахарида. Показано, что полученные гибридомы продуцируют моноклональные антитела к различным и, по-видимому, видоспецифическим эпитопам, ассоциированным с О-боковыми цепями липополисахарида, концентрация которых возрастала с понижением температуры культивирования бактерий. Установлено ингибирующее влияние протеиназы К, пепсина и трипсина на им-мунохимическую активность бактериальных клеток, определенную методом твердофазного имму-ноферментного анализа. Иммуноферментным методом показано, что на результаты реакции между использованными моноклональными антителами и антигенными препаратами (липополисахари-дами и микробными клетками) разнонаправленно влияет обработка перйодатом натрия, что может быть следствием различной локализации эпитопов липополисахарида, выявляемых моноклональ-ными антителами четырех линий.
DOI: 10.7868/S055510991402007X
Липополисахарид (ЛПС) — основной компонент наружного слоя внешней мембраны грамот-рицательных бактерий, определяющий их важнейшие иммунофизиологические свойства. ЛПС является мощным фактором патогенности иерси-ний, обусловливая токсичность, патологические изменения в сосудах микроциркуляторного русла, колонизирующую способность, устойчивость бактерий к антимикробным пептидам, сывороточному комплементу, антибиотикам и др. [1, 2]. Несомненна значимость ЛПС в развитии иммунных реакций, однако такого рода данные носят противоречивый характер. С одной стороны, ЛПС способен стимулировать врожденную и специфическую невосприимчивость макроорганизма по отношению к патогену [3, 4], с другой — может подавлять развитие иммуногенеза [5, 6]. Такой широкий спектр иммунобиологических эффектов ЛПС объясняется, по-видимому, таксономическими различиями, серовариабельно-стью используемых микроорганизмов, разнообразием методов выращивания культур штамма-продуцента, выделения и очистки, иных условий осуществления экспериментов, в том числе особенностями иммунофизиологического статуса макроорганизма. Показано, в частности, что от температуры культивирования иерсиний зависят
степень ацилирования липида А, полимеризации О-боковых цепей, размеры и состав кора ЛПС [2, 4, 7]. Термоиндуцибельные различия в химической и, как следствие, пространственной структуре поверхностных антигенов определяют разнообразие биологических свойств возбудителя в условиях in vitro и при взаимодействии с восприимчивым макроорганизмом (токсичность, адге-зивность, инвазивность, вирулентность, устойчивость к комплементу, антимикробным пептидам и др.) [2, 4, 7, 8]. Зависимость упомянутых свойств возбудителя от условий культивирования характерна для многих энтеробактерий, в том числе и для возбудителя псевдотуберкулеза.
Вместе с тем антигенная структура поверхностных компонентов псевдотуберкулезного микроба, связь между структурой ЛПС, его анти-генностью и иммунофизиологической значимостью исследованы в меньшей степени. Под термином "антигенность" здесь понимается способность биообъекта индуцировать образование комплементарных антител и (или) специфически взаимодействовать с ними. Такая работа предполагает применение не только поликлональных, но и моноклональных антител (МКАт) к различным эпитопам изучаемых антигенов.
203
6*
Цель работы — исследование с помощью мо-ноклональных антител антигенных свойств ЛПС Y. pseudotuberculosis серотипа 1b в зависимости от внешних воздействий, в том числе температуры выращивания микроорганизмов.
МЕТОДИКА
Штаммы и условия культивирования. Штамм Y. pseudotuberculosis 1b получен из коллекции Российского научно-исследовательского противочумного института "Микроб" (кат. № 474), который с 1980 г. хранился в лиофилизированнном состоянии; штамм EV Yersinia pestis, вакцинный, получен из коллекции ООО "Агровет".
Культуры иерсиний выращивали на плотной питательной среде на основе питательного агара "Биотехновация" (БТН-агар, Россия): Y. pseudotuberculosis при температуре 10 ("холодовая" культура) или 37°С в течение 7 или 3 сут соответственно, Y. pestis — при температуре 27° С в течение
2 сут. Микробные клетки для оценки их антиген-ности методом твердофазного иммунофермент-ного анализа (ИФА) инактивировали 0.5%-ным формальдегидом.
Выделение ЛПС. Препараты ЛПС выделяли из культур иерсиний методом Вестфаля с помощью водно-фенольной экстракции [9] и очищали трехкратным ультрацентрифугированием (105000 g,
3 ч). В качестве контроля использовали коммерческий препарат ЛПС, выделенный из клеток Escherichia coli 055:В5 ("Difco", США).
Гибридомы. Гибридомы четырех линий (№№ 1—4) к ЛПС Y. pseudotuberculosis, полученные ранее описанным способом [10] с незначительными модификациями, стабильны по антитело-продуцирующим и пролиферативным свойствам. Культуры указанных гибридом внутрибрюшинным способом вводили мышам линии BALB/с в дозе 2— 5 млн живых клеток на одно животное, через 9— 12 сут отсасывали и центрифугировали содержимое брюшной полости. В работе использовали соответствующие препараты надосадочной жидкости, обозначенные как МКАт1-4.
Электрофорез. Электрофоретическому разделению в ПААГ с Na-ДДС- по Лэммли[11] подвергали очищенные препараты ЛПС (нагрузка на дорожку — 12.5 мкг), поринов (нагрузка на дорожку — 10 мкг), а также вышеуказанные микробные клетки иерсиний (нагрузка на дорожку клеточного лизата соответствовала 200 х 106 кл.) после кипячения в течение 5 мин в литическом буфере (15 мин для поринов). Электрофорез проводили с помощью Protean II xi Cell ("Bio-Rad", США) при постоянной мощности 15 Вт в 12.5%-ном ПААГ размером 164 х 170 х 0.75 мм с добавлением 4 М мочевины. Окрашивание геля осуществляли по Цай и Фреш [12].
Иммуноблотинг. После электрофоретического разделения антигенные препараты методом полусухого переноса (в Trans-Blot SD semi-dry transfer cell, "Bio-Rad", США) переносили на нитроцел-люлозную бумагу ("Millipore", США) при силе тока 2 мА/см2 в течение 30 мин в буфере переноса (38.6 мМ глицин, 47.9 мМ трис, 20%-ный этанол). После инкубирования в течение 1 ч при комнатной температуре в блокирующем буфере (5% сухого обезжиренного молока в фосфатном буфере, рН 7.4) лист нитроцеллюлозы инкубировали в течение 3 ч при 26°С на шейкере IKA KS 4000 ic control ("IKA-Werke", Германия) при 100 качаниях/мин в буфере для гибридизации (5%-ного сухого обезжиренного молока в фосфатном буферном растворе, рН 7.4), содержащем монокло-нальные антитела в рабочем разведении: для МКАт1 — 1 : 2000 (в блотинге, результаты которого отражены на рис. 3 — 1 : 500), МКАт2 — 1 : 1000, МКАтЗ, 4 - 1 : 200.
По окончании гибридизации лист 3 раза по 5 мин выдерживали в буфере для отмывания (5%-ного сухого обезжиренного молока, 0.1%-ного твина-20 в фосфатном буфере, рН 7.4) и инкубировали в буфере для гибридизации, содержащем конъюгат пероксидазы с козьими антителами к иммуноглобулинам G, M, A мыши ("Sigma", США) в течение 2.5 ч при 26°С на шейкере при 100 качаниях/мин. Отмывку осуществляли сначала в буфере для отмывания (3 раза по 5 мин), а затем в 0.05 М Na-фосфатном буфере, рН 7.0, в течение 10 мин на шейкере при 100 качаниях/мин. Блот помещали в раствор субстрата (50 мМ Na-фосфатный буфер, рН 7.0, содержащий 2.3 мМ 3,3'-диаминобензи-дин хлорида, 0.005% пероксида водорода и 0.04% никеля двухлористого) до проявления окрашивания.
Перйодатное окисление. Для исследования методом ИФА инактивированные формальдегидом клетки ресуспендировали в 0.05 М ацетатном буфере, рН 5.2, со 100 мМ перйодата Na ("Acros Orga-nics", США) и инкубировали в течение 2 ч в защищенном от света месте при комнатной температуре. Суспензию центрифугировали (360 g, 10 мин) и клетки трижды отмывали в 0.05 М карбонат-бикар-бонатном буфере (КБК), рН 9.5, при том же режиме центрифугирования. Осадок клеток ресуспендировали в КБК до концентрации 2 х 108 кл./мл. Контролем служили микробные клетки, необработанные перйодатом Na, отмытые аналогично опытным образцам. Препараты ЛПС в концентации 1.0 мг/мл обрабатывались так же, как микробные культуры, исключая стадии отмывки, с последующим разведением КБК до концентрации 10 мкг/мл.
Для изучения влияния перйодатного окисления методом иммуноблотинга препараты ЛПС и инактивированные формальдегидом клетки раз-
(а)
(б)
МКАт1 МКАт2
МКАтЗ МКАт4
12 3 4 1 2 3
Рис. 1. Электрофореграмма препаратов ЛПС (а), окрашенная нитратом серебра [12], иммуноблот препаратов ЛПС с МКАт1-4 (б).
Препараты ЛПС выделены из культур Y. pseudotuberculosis, выращенных при температуре 10°С (1) и 37°С (2), из культуры Y. pestis, которую выращивали при температуре 27°С (3), а также коммерческий препарат ЛПС E. coli 055:В5 (4).
водили до концентраций 1.0 мг/мл и 1010 кл./мл соответственно в 0.05 М ацетатном буфере с 400 мМ перйодатом Na. После инкубации в течение 2 ч при комнатной температуре в защищенном от света месте препараты диализовали в дистиллированной воде в течение 1 сут. В качестве контроля использовались необработанные перйодатом препараты ЛПС и клеток, подвергшиеся диализу. Дальнейшую подготовку препаратов проводили, как описано в методике электрофореза.
Обработка протеазами. Для исследования методом ИФА инактивированные формальдегидом клетки ресуспендировали в забуференном физрастворе, рН 7.3, с 0.2 мг/мл фермента (протеина-за К, КФ 3.4.21.64, "Serva", США; трипсин КФ 3.4.21.4, "Ferak Berlin GmbH", Германия; пепсин КФ 3.4.23.1 "Реахим", Росс
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.