научная статья по теме ИССЛЕДОВАНИЕ ПРЕВРАЩЕНИЯ ПРОМЫШЛЕННЫХ ОТХОДОВ РАСТИТЕЛЬНОГО СЫРЬЯ В КЛЮЧЕВЫЕ ПОЛУПРОДУКТЫ ФАРМАЦЕВТИЧЕСКИХ СУБСТАНЦИЙ БИОТЕХНОЛОГИЧЕСКИМИ МЕТОДАМИ Химия

Текст научной статьи на тему «ИССЛЕДОВАНИЕ ПРЕВРАЩЕНИЯ ПРОМЫШЛЕННЫХ ОТХОДОВ РАСТИТЕЛЬНОГО СЫРЬЯ В КЛЮЧЕВЫЕ ПОЛУПРОДУКТЫ ФАРМАЦЕВТИЧЕСКИХ СУБСТАНЦИЙ БИОТЕХНОЛОГИЧЕСКИМИ МЕТОДАМИ»

ХИМИЧЕСКАЯ ФИЗИКА, 2015, том 34, № 6, с. 38-47

ХИМИЧЕСКАЯ ФИЗИКА ЭКОЛОГИЧЕСКИХ ПРОЦЕССОВ

УДК 535.71; 577.152.3; 547.9/339.2; 542.957.2.002

ИССЛЕДОВАНИЕ ПРЕВРАЩЕНИЯ ПРОМЫШЛЕННЫХ ОТХОДОВ

РАСТИТЕЛЬНОГО СЫРЬЯ В КЛЮЧЕВЫЕ ПОЛУПРОДУКТЫ ФАРМАЦЕВТИЧЕСКИХ СУБСТАНЦИЙ БИОТЕХНОЛОГИЧЕСКИМИ

МЕТОДАМИ

© 2015 г. Д. В. Довбня, С. М. Хомутов, В. В. Фокина*, М. В. Донова

Институт биохимии и физиологии микроорганизмов им. Г.К. Скрябина Российской академии наук, Пущино, Московская область *Е-таИ: vvfokina@rambler.ru Поступила в редакцию 31.10.2014

Селективная микробиологическая конверсия растительных стеринов позволяет получить ключевой интермедиат синтеза жизненно важных стероидных фармацевтических субстанций группы глюкокортикоидов — 9а-гидроксиандрост-4-ен-3,17-дион (9-ОН-АД). В настоящей работе показано, что в качестве субстратов для микробиологической трансформации можно использовать обогащенные стеринами промышленные отходы переработки растительного сырья, а именно неомыля-емый остаток таллового пека и его производные. Ряд простых и эффективных 1-2-стадийных методов фракционирования позволил получить производные, содержащие 51—88% (по массе) трансформируемых стеринов. Проведен сравнительный анализ динамики процессов биоконверсии полученных стеринобогащенных фракций таллового пека и коммерческого фитостерина. Показано, что биоконверсия ряда обогащенных стеринами образцов при скорости накопления продукта, в 2—2.5 раза меньшей, чем в контрольном образце (коммерческий фитостерин), приводит к достижению приемлемых значений мольного выхода 9-ОН-АД в интервале 53—57%. Полученные результаты позволяют сократить технологический путь от первичных продуктов переработки возобновляемого сырья (сопутствующие продукты переработки древесины) до целевых стероидных фармацевтических субстанций, получаемых из 9-ОН-АД.

Ключевые слова: стероиды, стерины, фитостерин, талловый пек, биоконверсия, микробиологическая трансформация, утилизация отходов, глюкокортикоиды.

Б01: 10.7868/80207401X15060035

ВВЕДЕНИЕ

Стероиды занимают одно из важнейших мест среди лекарственных препаратов, применяемых для лечения различных групп заболеваний [1]. Дексаметазон (9а-фтор-110,17,21-тригидрокси-16а-метилпрегна-1,4-диен-3,20-дион) является одним из наиболее эффективных и востребованных стероидных препаратов, входящих в перечень жизненно-необходимых лекарственных средств. Получение субстанций фторированных глюкокортикоидов из группы 17а-гидрокси-16а-метилпре-гнанов — одна из задач государственной политики в области обеспечения химической и биологической безопасности, связанной с разработкой технологий получения и производством лекарственных препаратов [2].

В настоящее время в качестве стартового сырья для получения фармацевтических стероидов наиболее часто используют стерины растительного или животного происхождения [3]. Сово-

купность технологических этапов производства стероидов, таким образом, включает получение стеринов, их микробиологическую конверсию в ключевые полупродукты, а также методы синтеза конечных фармацевтических субстанций, которые, в свою очередь, могут включать биотехнологические стадии и/или стадии химического синтеза.

Наиболее экономически привлекательными источниками получения стеринов являются отходы или сопутствующие продукты пищевой и лесохимической промышленности. Последнее особенно актуально для России, где только в 2010 году было произведено 10 млн т целлюлозы (1/20 от объема мирового производства).

Для биотехнологического получения стероидных полупродуктов необходимо использование так называемых трансформируемых стеринов: холестерина, Р-ситостерина, ситостанола, кампе-стерина, стигмастерина, стигмастанола, кампеста-

нола, брассикастерина и т.п. При этом холестерин в подавляющем большинстве случаев имеет животное происхождение, а такие стерины, как стигма-стерин или брассикастерин, получают в основном из масличных культур [4]. В промышленной биотехнологии вместо индивидуальных растительных стеринов используют фитостерин, который представляет собой очищенную смесь трансформируемых стеринов, поскольку их выделение и очистка до индивидуального состояния является дорогостоящей и технологически неоправданной процедурой [5, 6].

В настоящее время до 70% целлюлозы в мире производится сульфатным способом, в котором первой технологической субстанцией, содержащей стерины, является черный щелок. В нашей стране при производстве 1 т целлюлозы образуется от 35 до 120 кг черного щелока. Из черного щелока путем отстаивания получают сырое сульфатное мыло. Поскольку одной из основных задач производства, помимо извлечения химических субстанций, является выработка тепловой энергии для поддержания варочного процесса, черный щелок и часть сырого сульфатного мыла обычно сжигают [7].

Однако в случае переработки сырого сульфатного мыла ценность содержащихся в нем соединений существенно превышает его ценность как топлива. В результате кислотной обработки сырого сульфатного мыла получают талловое масло, а при его вакуумной ректификации — нелетучий остаток — талловый пек (ТП), который содержит в том числе до 6% стеринов в свободной и этери-фицированной формах [8]. Содержащиеся в тал-ловом пеке стерины могут быть извлечены путем щелочного гидролиза и экстракции и полностью очищены до фитостерина. При этом для целей микробиологической трансформации может быть достаточным получение обогащенной сте-ринами фракции. Попытки изучения возможности эффективной биоконверсии таких фракций, полученных из отходов национального производства США, Польши, Португалии, были предприняты рядом авторов [9—11].

Традиционно в качестве ключевых предшественников в широком спектре стероидных синтезов используют продукты биоконверсии стеринов: андрост-4-ен-3,17-дион или андроста-1,4-диен-3,17-дион [11]. Ряд функциональных групп может быть введен в данные соединения методами химического синтеза или биотехнологически [12—14]. Уникальный штамм Mycobacterium sp. В КМ Ас-1817Д обладает способностью к селективной деградации боковой цепи стеринов с параллельным регио- и стереоселективным введением гидрок-сигруппы в положение 9а стероидного ядра, что может быть осуществлено в одну биотехнологическую стадию [15]. Наличие данного заместите-

ля в предшественнике существенно сокращает путь синтеза до соответствующих 9(1 ^-ненасыщенных полупродуктов и далее — до галогензаме-щенных глюкокортикоидов [16]. В данной работе мы использовали культуру Mycobacterium sp. ВКМ Ас-1817Д для получения 9а-гидроксиандрост-4-ен-3,17-диона (9-ОН-АД) методом биоконверсии стеринов, содержащихся в обогащенных фракциях таллового пека.

Цель данной работы — получение обогащенных стеринами фракций промышленного отхода — таллового пека и оценка эффективности микробиологической конверсии полученных фракций в 9-ОН-АД — ключевой интермедиат синтеза фармацевтических субстанций.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

В качестве промышленного отхода был использован образец таллового пека отечественного предприятия ОАО "Усть-Илимский ЛПК"; в качестве контроля использовали очищенный коммерческий фитостерин таллового происхождения Kaukas Ultra с содержанием ß-ситостерина, составляющим 91.6% (Kaukas OY, Финляндия). В качестве аналитических стандартов использовали индивидуальные стерины: холестерин, ß-сито-стерин (Serva, Германия), 9-ОН-АД (чистота — 99.1%, T^ = 217—220°C, молярный коэффициент экстинкции s при длине волны 240 нм в этаноле — 14780 M-1 • см-1). Последний получен в лаборатории микробиологической трансформации органических соединений ИБФМ РАН; другие материалы — российского производства.

Штамм Mycobacterium sp. ВКМ Ас-1817Д был получен из Всероссийской коллекции микроорганизмов ИБФМ РАН (ВКМ ИБФМ РАН). Культивирование штамма осуществляли, как описано ранее [15].

УСЛОВИЯ ЭКСПЕРИМЕНТОВ

Получение неомьляемого остатка стеринсодержащих отходов [11]

Получение неомыляемого остатка таллового пека (НОТП) — высушенные в вакууме при 70°С до постоянного веса навески таллового пека массой 100 г эмульгировали в 230 мл смеси 13.6 М водного раствора гидроксида калия и этанола, взятых в объемном соотношении 1 : 8. Полученные эмульсии выдерживали в течение 3 ч при энергичном перемешивании. Затем экстрагировали неомыляемые остатки путем добавления 300 мл смеси гексана и этилацетата (при объемных соотношениях 5 : 1). Органический слой отделяли в делительной воронке. Операцию повторяли 3 раза. Органическую фазу промывали 0.5 M водным раствором гидроокиси натрия, затем трижды —

водой до нейтральной реакции. Далее к органической фазе прибавляли сульфат натрия и высушивали в течение 12 ч. Сульфат натрия отфильтровывали, промывали двумя порциями гексана по 50 мл. Органические растворители отгоняли на вакуумном испарителе, и остатки высушивали до постоянного веса. Получали неомыляемый остаток таллового пека (табл. 1).

Получение обогащенных по стериновой составляющей производных НОТП

Кристаллизация из смеси этилового спирта и гексана — навеску НОТП (20 г) растворяли в 100 мл смеси этилового спирта и гексана (при объемном соотношении 10 : 1) при нагревании до 60—65°С и энергичном перемешивании. Полученный раствор охлаждали до 4°С. Выпавшие кристаллы отфильтровывали на бумажном фильтре, промывали 10 мл охлажденного этилового спирта, отжимали на фильтре, высушивали при 50°С и получали НОТП-1 (табл. 2). Процедуру перекристаллизации повторяли — получали НОТП-1.1 (табл. 2).

Кристаллизация из смеси органических растворителей гексан-ацетон-метанол-вода — навеску НОТП (20 г) растворяли в 100 мл смеси органических растворителей гексан—ацетон—метанол—вода, взятых в объемном соотношении 49.3 : 34 : 15.1 : 1.6. Раствор упаривали в вакууме при температуре 45—50°С до начала выпадения осадка. Затем раствор переносили в кристаллизатор и охлаждали в холодильнике. Выпавшие кристаллы фильтровали через бумажный фильтр № 1 и высушивали в сушильном шкафу при температуре 60°С. Маточный раствор упаривали на вакуумном испарителе досуха, и процедуру повторяли. Получали НОТП-2 (табл. 2).

Кристаллизация из предварительно насыщенного водой этилацетата [17] — навеску НОТП (10 г)

Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.

Показать целиком