w
БИООРГАНИЧЕСКАЯ ХИМИЯ
Том 19 * № 2 * 1993
УДК 577.151' 162.088.53:577.334
© 1993 г. Б. П. Николаев, Д. К. Торопов, А. М. Шляков
ИССЛЕДОВАНИЕ РАБОТЫ МУЛЬТИФЕРМЕНТНЫХ СИСТЕМ КЛЕТОЧНЫХ СТРУКТУР Escherichia coli В МИКРОЭМУЛЬСИОННЫХ ОРГАНИЧЕСКИХ СРЕДАХ МЕТОДАМИ 3|Р-ЯМР И СПИНОВОГО ЗОНДИРОВАНИЯ
Всероссийский научно-исследовательский институт особо чистых биопретратов,
Ca. [кт-Летербург
В микроэмульсионных тройных композициях на основе тридекана, неионного детергента Твин 81 и контролируемого небольшого количества воды методом 3|Р-ЯМР изучена кинетика утилизации глюкоза-6-фосфата (G6P), уровня неорганического фосфата Pi и других метаболитов у Е. coli. Работа электрон-транспортной цепи мембран клеток оценивалась по скорости восстановления экзогенных нитроксильных радикалов. Обнаруженное торможение ферментативной активности белков глцколиза и ЭТИ клеточных структур вызывается понижением активности воды aw внешней микроэмульсионной среды без перехода липопротеинов клеточной стенки в мицелляриые формы. Регуляция ферментативных процессов осуществляется через лимитирование мицеллярной диффузии субстрата и уменьшение активности воды а* при интенсивном межмолекулярном обмене связанной воды микроэмульсионной фазы и белков клеточных структур.
В настоящее время считается, что для проявления каталитической активности ферментов наличие воды в качестве свободного растворителя не обязательно, а для стабилизации нативной глобулярной организации молекулы фермента достаточно мономолекулярного гидратного слоя. Такую точку зрения подтверждают эксперименты по осуществлению ферментативных реакций с участием гидролаз, оксиредуктаз, протеиназ и электронпереносящих белков группы цитохромов в мицеллярных органических средах как с малым содержанием воды [1—7], так и в абсолютно сухих полярных растворителях [8, 9]. Микроэмульсии оказались особенно удобными объектами для изучения ферментативного катализа, так как в них мягкую солюбилизацию белка можно сочетать с гибким изменением содержания воды. В микроэмульсиях удается реализовать последовательные цепи реакций с участием нескольких ферментов, например лактатдегидрогеназы и пируваткиназы, глюкозоксидазы и каталазы [2, 10].
Удачная реконструкция работы мультиферментных комплексов митохондри-альной АТР-азы в микроэмульсиях толуола, стабилизированных Тритоном Х-100 и фосфолипидами, доказывает возможность совмещения их субъединичных белков с органическими растворителями и ПАВ [11]. Исследование реакций метаболизма, катализируемых ферментами Е. coli в микроэмульсионных органических средах, представляет практический интерес для решения проблем микробной трансформации органических соединений в биореакторах [12]. Прямое изучение ферментативных реакций в обезвоженных клетках также существенно для разработки методов консервации ферментных препаратов и изучения анабиоза [13].
Сокращения: G6P — глюкоза-6-фосфат, ЭТЦ — электрон-транспортная цепь клетки, FDP — фруктоза-1,6^дифосфат, TEMPOL — 2,2,6,б-тетраметилпиперидин-4-оксипиперазин-1-оксил, 5DS — 5-доксилстеариновая кислота, ТЕМПО — 2,2,6,6-тетраметилпиперидин-1-оксил, СТВ — сверхтонкое взаимодействие.
бода
Рис. 1. Фазовая диаграмма тройной системы Твин 81—тридекан — вода при 18° С. I — изотропная фаза, I« — жидкокристаллическая фаза, 2ф — двухфазные микроэмульсии, Зф — область трехфазных равновесий, I — линия изменения содержания воды в микроэмульсионных препаратах клеток Е. coli
Тестирование биохимических реакций обычно осуществляют дезинтегрированием клеточных препаратов и экстракцией ферментов водно-солевыми растворами. Это резко ограничивает возможности работы с интегральными белками в органических средах или с интактным клеточным материалом. Ненарушающие методы спектроскопии ЯМР и ЭПР выгодно отличаются возможностью исследования реакций метаболизма в интактных клетках и тканях [14]. Так, методом Р-ЯМР были подробно изучены пути метаболических превращений фосфорилированных интермедиатов в клетках Е. coli [16—18], в грамположительных бактериях [19, 20], в клетках дрожжей [21 ], в растительных клетках и в форменных элементах крови [22 ]. Все известные примеры изучения ферментативных реакций относятся к оводненным, илй регидратированным, клеткам, в которых влияние активности воды рассматривается в совокупном трудно интерпретируемом результате общей процедуры обезвоживания — регидратации [13].
В данной работе измерение уровня метаболитов — интермедиатов гликолити-ческих и окислительно-восстановительных реакций клеточных структур бактерий Е. coli — мы осуществляли непосредственно в момент установления требуемых значений активности воды aw. Измерения выполнены последовательным измерением спектров 31 Р-ЯМР и ЭПР первичных метаболитов клеток, помещаемых в жидкие органические среды с регулируемым содержанием воды. Беспрепятственный подвод субстратов обеспечивали через органические среды благодаря высокой солюбилизирующей способности выбранного типа микроэмульсии. Для этих целей нами разработана тройная композиция тридекан — вода — Твин 81, не оказывающая инактивирующего действия на клетки Е. coli при высоком содержании ПАВ (25 об.%). По данным предварительного изучения физико-хи-мических свойств, наша система относится к типу микроэмульсий Винзора II. При избыточном содержании воды (18 об.%, 20°С) она образует двухфазные микроэмульсии (рис. 1), а в области I фазовой диаграммы дает устойчивую «гомогенную» фазу с мицеллами нанометрового размера. Капли микроэмульсии имеют вид обращенных мицелл: их ядра состоят из свободной воды и гидратной воды полиоксиэтильных групп Твин 81. Свободная вода мицеллы образует зону солюбилизации молекул глюкоза-6-фосфата (G6P) и спиновых зондов. Предварительные данные о спектральном поведении спиновых зондов, ядер Н, Н воды и Твина 81 были получены ранее [23, 24 ]. Предложенная микроэмульсионная система подчиняется общим закономерностям поведения микроэмульсий на основе полиоксиэтилированных ПАВ типа CiEOj [25, 26], она обнаруживает более высокую температурную чувствительность агрегатного состояния по сравнению с системами ионных ПАВ и в отличие от них не оказывает лизирующего действия на микроорганизмы.
г о -г м.д.
Рис. 2. Динамика изменения во времени вида спектров 31Р-ЯМР суспензии клеток Е. coli (5-lö" глеток/мл, 22° С) в физиологическом растворе после прибавления глюкоза-б-фосфата в анаэробных условиях
Функционирование гликолитических ферментов клетки Е. coli
Спектры 01Р-ЯМР концентрированных суспензий клеток Е. coli (10 клеток/мл) мы измеряли в ампулах малого объема (2 мл) при лимитации по фосфору и кислороду. По оценкам парамагнитного измерения линий радикалов в спектрах ЭПР, анвксия наступала практически сразу после заливки суспензии клеток в ампулу спектрометра. Поэтому измеренные спектры Я MP клеток отражают условия анаэробиоза, при которых Е. coli быстро расходует эндогенные макроэргические соединения АТР и ADP и теряет трансмембранный потенциал. В отличие от спектров 31Р-ЯМР клеток Е. coli активного дыхания, выращенных на богатой питательной среде [16, 17], в спектрах клеток, поставленных в
условиях анаэробиоза, остаются пики внутреннего (/*/п) и внеклеточного орто-фосфата СР?Ш) и сигнал резонанса G6P (рис. 2). В области химических сдвигов 5—10 м.д. наблюдались слабые уширенные сигналы нуклеозидфосфатов. При интенсивной оксигенации и при добавлении глюкозы происходило расщепление сигнала ортофосфата Pi из-за возникновения градиента pH в мембранах.
В суспензии клеток на стационарной фазе роста значения pH составляли рНш 6,7 и pHout 6,55. На первых минутах утилизации G6P клетками микроэмуль-гированных препаратов в результате реакции, катализируемой фосфофруктсхи-назой с участием АТР [27 ], в спектрах наблюдалось появление сигнала второго ключевого продукта гликолиза — фруктоза- 1,6-дифосфата (FDP). В ходе синтеза последнего отмечалось аномальное смещение сигнала G6P в сильное поле.
Динамика изменения вида спектра ЯМР состояла в уменьшении интенсивности пика G6P и нарастании пика неорганического фосфата с общим монотонным смещением пиков G6P и Л в сторону сильного поля. В водкой суспензии клеток Е. coli полная утилизация G6P завершалась в течение ] ч, а в микроэмульги-рованных системах его усвоение замедлялось. В микроэмульсиях с содержанием воды 3% остаточный уровень субстрата составлял около 70%. Прекращение реакции фосфорилирования и достижение порогового насыщения по ортофосфату Р\ проходило симбатно. При инактивации клеток гликолитическое усвоение G6P снижалось до нуля. Активное усвоение G6P, сопутствующее накопление фос-фатсахаров и подкисление среды присуще только неповрежденным мембранам Е. coli, а при повреждении мембран в процессе конвективной сушки клетки утрачивают способность понижать pH среды [28, 29]. Механизм гликолиза Е. coli на богатых глюкозой питательных средах подробно изучен й работах [16, 27], и картина изменений спектров 1Р~ЯМР является отражением хода реакций, катализируемых ферментами гликолиза [29—32 ]. При проверке действия лизатов клеток на скорость расщепления G6P в микроэмульсионных средах не было обнаружено заметного разложения G6P в течение контрольного времени.
Включение клеток Е. coli в микроэмульсионные среды различной влажности мы проводили так, чтобы объем микроэмульсии многократно превышал биомассу бактерий. При этом было обнаружено, что последовательности наступления спектральных изменений резонанса Р фосфорсодержащих метаболитов в микроэмульсионных средах и в водных суспензиях не различались. Динамика изменений химического сдвига (6) и интенсивности пиксв (!) резонанса G6P и Р\ в процессе анаэробной утилизации G6P в эмульсионных препаратах и в водной суспензии клеток приведена на рис. 3—6. Как можно видеть из этих рисунков, реакция гликолиза G6P заметно замедляется по мере уменьшения содержания воды в микроэмульсии. Мы считаем, что торможение ферментативных реакций расщепления G6P при обработке клеток Е. сой углеводородными растворами Твина 81 не связано с разрушением липопротеинового матрикса мембран. Действительно, известно, что при жидкокристаллической,
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.