БИОЛОГИЧЕСКИЕ МЕМБРАНЫ, 2008, том 25, № 3, с. 203-209
УДК 577.152.577.355.581.132
ИССЛЕДОВАНИЕ РАННИХ ФОТОАКТИВНЫХ ФОРМ ПРЕДШЕСТВЕННИКА ХЛОРОФИЛЛА В ЛИСТЬЯХ РАСТЕНИЙ С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ ФЛУОРЕСЦЕНТНОЙ СПЕКТРОСКОПИИ ПРИ 20°C
© 2008 г. В. Т. Дубровский, Ф. Ф. Литвин
Биологический факультет Московского государственного университета им. М.В. Ломоносова,
119991, Москва, Ленинские горы, д. 1, стр. 12; факс (495)-939-43-09; электронная почта: litvinff@mail.ru Поступила в редакцию 27.12.2007 г.
С использованием флуоресцентной спектроскопии прослежено накопление нескольких форм пигмента-предшественника на ранних стадиях их образования при 20°C. Торможение фотореакции во время измерения спектров флуоресценции при 20°С достигалось понижением интенсивности возбуждающего света. Высокий выход начальной флуоресценции коротковолновой формы 638 нм в зародышевых листьях резко падает по мере накопления пигмента-предшественника. Выход флуоресценции основной формы с максимумом около 653-655 нм уменьшается менее резко. При понижении температуры до -196°C обнаружено сильное возгорание флуоресценции, особенно выраженное (в 10 раз) у основной формы предшественника хлорофилла. Изменения спектров флуоресценции в процессе фотопревращения свидетельствуют о том, что на ранних стадиях протекает только первая из двух последовательных реакций фотовосстановления предшественника in vivo. Сложный характер кинетических кривых флуоресценции в ходе фотореакции обусловлен сочетанием эффектов изменения концентрации и квантовых выходов превращающихся форм пигмента.
Заключительная стадия биосинтеза хлорофилла - фотохимическое гидрирование темнового предшественника протохлорофиллида до хлоро-филлида - осуществляется с участием фермента протохлорофиллид-оксидоредуктазы и NADH [1]. Спектроскопические исследования показали, что в целых клетках этот сложный процесс включает ряд фотохимических и темновых реакций, в которые вовлечены несколько спектроскопически различных лабильных состояний хромофора пигмент-белковых комплексов предшественника и его фотопродуктов. Особенно эффективными оказались исследования заключительных стадий биосинтеза хлорофилла непосредственно в клетке с использованием флуоресцентного метода. Однако его применение связано с существенными ограничениями, поскольку возбуждающий флуоресценцию свет одновременно инициирует и фотохимические реакции превращения предшественника. Одним из нас и A.A. Красновским [2] был предложен метод измерения спектров этиолированных листьев в условиях торможения фотохимической реакции глубоким охлаждением объекта (до -196°C), получивший широкое распространение и позволивший накопить обширную информацию о путях превращения предшественника в хлорофилл, его включении в две фотохимические системы и о биосинтезе феофитина (см. обзоры [3-5]). Вместе с тем, применение низких температур связано с рядом ограничений. В этих экспериментах процесс проводили при физиологических температурах, а о результате судили после
его прерывания замораживанием с последующим измерением спектров при низкой температуре и сменой объекта для исследования следующей стадии.
Мы попытались устранить эти ограничения за счет повышения чувствительности установки, которое позволило понизить интенсивность света, возбуждающего флуоресценцию, настолько, что она практически не вызывает фотопревращения и не оказывает влияния на форму спектров, измеряемых при комнатной температуре. При этом оказалось возможным проводить измерения спектров и кинетики реакций на одном и том же объекте непосредственно в ходе фотопроцесса в физиологических условиях даже на целых растениях. Кроме того, повышение чувствительности позволило перейти к изучению пигмента-предшественника на самых ранних стадиях его образования в зародышевых этиолированных листьях (когда концентрация пигмента на порядок ниже, чем в обычно исследуемых листьях).
В данной работе представлены первые результаты (главным образом феноменологического характера) исследований пигмента-предшественника с самых начальных этапов его образования - спектров, квантового выхода, температурной зависимости.
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ
Объектом спектральных исследований служили этиолированные и зеленеющие листья фасоли (сорт спаржевый Сакса). Семена замачивали в во-
Рис. 1. Изменение спектров поглощения (а) и спектров флуоресценции (•) при накоплении предшественника. Измерение спектров при 20°С, возбуждающий свет 445 нм. 1 - Зародышевые листья; 2 - этиолированные 2-дневные листья; 3 -этиолированные 4-дневные листья. В - оптическая плотность, ¥ - интенсивность флуоресценции, отн. ед.
допроводной воде в чашках Петри в темноте при 20°С. После инкубирования в таких условиях в течение 2-3 сут из части растений (при слабом освещении зеленым светом) извлекали этиолированные зародышевые листья, находившиеся между еще сомкнутыми семядолями (далее - "зародышевые листья"). Остальные растения переносили в термостат для выращивания на водопроводной воде при 26°С также в темноте. Листья этих проростков отбирали на разных стадиях - от 2 до 7 дней (далее - "этиолированные листья", с указанием сроков инкубирования в термостате).
Для измерения спектров листья помещали в плоские оптические кюветы (один слой из 10-15 зародышевых листьев или 2-4 этиолированных листьев). Кюветы позволяли проводить на одном и том же образце измерение спектров поглощения и флуоресценции при комнатной температуре и при -196°С.
Спектры флуоресценции измеряли на описанной ранее [6] модифицированной установке КСВУ-12 с двумя светосильными монохроматорами, фотоумножителем и системой обработки сигнала. Установка позволяла измерять спектры флуоресценции, возбуждения флуоресценции и соответствующие вторые производные с использованием дополнительного источника света для инициирования фотохимической реакции.
За счет достаточно высокой чувствительности оказалось возможным понизить интенсивность возбуждающего света вплоть до порога, при котором реакция превращения предшественника за время записи спектра практически не происходила (доза 0.2 Дж/м2, фотопревращение менее 10%). Это давало возможность получить хорошо воспроизводимые спектры флуоресценции этиолированных листьев при комнатной температуре, начиная
с самых ранних стадий накопления предшественника.
Флуоресценцию измеряли при возбуждении монохроматическим светом в области полосы Соре предшественника (445 нм), спектральная ширина щелей монохроматора при измерении флуоресценции составляла 0.2 нм при -196°C, для объектов при комнатной температуре - 4 нм. Время записи спектра 1.5 мин. Спектры поглощения измеряли на спектрофотометре Specord ("Carl Zeiss", Германия) с интегрирующей сферой.
РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ
Образование пигмент-белковых комплексов предшественника было прослежено с самых ранних стадий, начиная с еще неразвернувшихся этиолированных зародышевых листьев, находящихся между семядолями (первые 2-3 сут замачивания семян). На спектрах поглощения, измеренных при комнатной температуре со светособирающей сферой, видны очень слабо выраженные полосы в коротковолновой и длинноволновой области. Общая величина поглощения постепенно растет (рис. 1а), при этом становится заметным появление структуры спектров, отчетливо выраженное на второй производной (основные максимумы около 630 и 650 нм).
На тех же стадиях процесса (и на тех же образцах) были прослежены изменения спектров флуоресценции этиолированных зародышевых листьев при комнатной температуре. Как видно из рис. 16, характер изменения спектров флуоресценции существенно отличается от изменений спектров поглощения, при этом интенсивность флуоресценции не возрастает, а уменьшается по мере увеличения поглощения, т.е. при накоплении предшественника.
Обращает на себя внимание и тот факт, что на ранних стадиях у зародышевых листьев преобладает флуоресценция коротковолновой (максимум около 637 нм), а не длинноволновой формы предшественника, проявляющейся на спектре сначала в виде плеча, а затем, у этиолированных листьев, главного максимума (650-653 нм). Интересно также отметить, что у полученной серии спектральных кривых существует "изобестическая" точка около 655 нм, при этой длине волны интенсивность флуоресценции не возрастает, несмотря на многократное увеличение поглощения (от кривой 1 до кривой 3 - в 15 раз).
Сопоставление данных абсорбционных и флуоресцентных измерений свидетельствует об изменении квантового выхода флуоресценции различных нативных форм предшественника по мере их накопления в этиолированном листе. Для количественной характеристики этих изменений было рассчитано отношение интенсивности флуоресценции к величине оптической плотности при 650 нм (на основном участке кривой до В < 0.2 оптическую плотность можно считать пропорциональной поглощению (1 - Т)). Интенсивность флуоресценции отдельных форм рассчитывали путем разложения спектральной кривой на гауссовские компоненты с использованием данных о положении максимумов излучения по второй производной.
Как видно из рис. 2, на начальных стадиях накопления предшественника наблюдается быстрое падение относительного выхода флуоресценции этиолированных листьев. Особенно выражено оно у наиболее коротковолновой формы (кривая 1), выход флуоресценции которой понижается более чем в 20 раз при возрастании поглощения от 0.01 до 0.1. В отличие от этого, выход флуоресценции самой длинноволновой формы 670 нм на начальном этапе существенно ниже выхода для формы с максимумом флуоресценции при 637 нм и падение ее эффективности менее резко выражено.
Представлялось интересным сопоставить интенсивность флуоресценции предшественника (протохлорофиллида) в этиолированных листьях и хлорофилла выращенных на свету проростков при одинаковой оптической плотности В = 0.2 в их максимумах поглощения. Оказывается, что флуоресценция предшественника в несколько (5-7) раз выше, чем хлорофилла зеленеющих листьев (см. рис. 2).
Таким образом, флуоресценция пигмента-предшественника сильно тушится по мере его накопления в этиолированных листьях. Оказалось, что тушение проявляет сильно выраженную температурную зависимость,
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.