ГЕНЕТИКА, 2013, том 49, № 1, с. 55-72
УДК 576.7+57.017.35
ИССЛЕДОВАНИЕ РЕГЕНЕРАЦИИ У АМФИБИЙ В ЭПОХУ МОЛЕКУЛЯРНО-ГЕНЕТИЧЕСКИХ ПОДХОДОВ И МЕТОДОВ
© 2013 г. Э. Н. Григорян, Ю. В. Маркитантова, П. П. Авдонин, Е. А. Радугина
Институт биологии развития им. Н.К. Кольцова Российской академии наук, Москва 119334
e-mail: e.grigoryan@hotmail.com Поступила в редакцию 27.06.2012 г.
В обзоре представлены результаты изучения молекулярно-генетических механизмов регенерации у амфибий. На примере традиционных и хорошо изученных ранее моделей — восстановление сетчатки и хрусталика глаза, а также конечности и хвоста у амфибий — проанализированы современное состояние проблемы регенерации и вопросы, связанные с репрограммированием клеток, клеточным ростом и морфогенезом. Прослежено развитие идей школы Н.К. Кольцова в эпоху молекуляр-но-генетических подходов и методов. Предложены современная трактовка органной регенерации в терминах ее молекулярно-генетической регуляции и новый взгляд на определение регенерации в качестве "повторного развития". Обозначены современные проблемы этого раздела биологии развития, обусловленные трудностями секвенирования геномов и внедрения методов трансгенеза у Urodela — животных с наиболее высокими регенерационными способностями.
DOI: 10.7868/S0016675813010049
Исследования развития и регенерации глаза и конечностей низших позвоночных являлись приоритетными в отечественной экспериментальной эмбриологии со времен ее начала, положенного Н.К. Кольцовым и его первыми последователями. В первую очередь это были работы ученика Н.К. Кольцова — Д.П. Филатова, перешедшие затем в планомерные исследования по механике развития (труды Б.И. Балинского, Т.А. Детлаф, Н.И. Драгомирова, Л.В. Полежаева, В.В. Попова, Г.В. Лопашова и др.). Исследования в области экспериментальной эмбриологии, успешно проводившиеся в 1920-1940-е годы, были практически прекращены после сессии ВАСХНИЛ 1948 г. и возобновлены в конце 1950-х годов — время становления отечественной биологии развития [1]. Инициация исследований регенерации у амфибий и обращение к ним вновь после 1948 г. были обусловлены пониманием того, что модели органной регенерации ("повторного развития") дают незаменимую информацию для раскрытия механизмов развития и восстановления органов и тканей в эволюционном ряду у человека.
Прогресс этого направления науки зависел от разработки и продвижения новых технологий для изучения тканевых, клеточных и молекулярных событий в ходе регенерации. То, что модели при этом на протяжении большого отрезка времени оставались традиционными, позволяло накапливать информацию, полученную в разное время и на разных уровнях изучения. Во второй половине прошлого столетия наиболее широко эксплуатировались системы развития и регенерации тканей
глаза и конечностей у амфибий. Использование взрослых тритонов, лягушек до и после метаморфоза, амбистом и саламандр было продиктовано, прежде всего, их высокими регенерационными способностями, а также доступностью в результате искусственного разведения этих животных в аквариальной ИБР им. Н.К. Кольцова РАН.
Для изучения регенерации у амфибий наши предшественники использовали практически все известные экспериментальные приемы и методы: микрохирургию и трансплантации, детальные исследования на морфологическом уровне (от макроморфологии до электронной микроскопии), изучение методами биохимии (от выделения грубых экстрактов до определения паттерна экспрессии регуляторных, синтезируемых в малых количествах, продуктов). Большим достижением явилось внедрение методов определения проли-феративной активности клеток и фаз клеточного цикла в динамике и на разных этапах восстановления регенерирующих тканей, а также иммуно-химических методов для выявления интересующих общих белков и белков, специфичных для определенных клеточных типов регенерирующих тканей.
Отметим, что в далекие 1930-е годы Н.К. Кольцов неоднократно обращался к тесной связи механики развития и генетики, рассматривая индивидуальное развитие как комплексную проблему, включающую все биологические дисциплины [1]. В выступлениях и публикациях он обращал внимание на то, что "... для физиологии развития очень важно связать свою научную область с ге-
нетикой, цитологией и биохимией" [2]. Однако потребовалось больше чем полстолетия, чтобы происходящее при регенерации на тканевом и клеточном уровнях могло быть хоть как-то увязано с молекулярно-генетическими механизмами процесса. До наступления эпохи молекулярно-генетических исследований и с ее приходом двумя наиболее широкими направлениями в регенерации были: 1) поиск ключей к пониманию, почему у одних животных регенерация происходит, а у других — нет и попытки стимулировать регенерацию; 2) является ли регенерация повторением процесса развития или для регенерации используются специальные генетические программы.
Развитие и регенерация тканей глаза — направление, берущее свое начало из отдела механики развития, возглавляемого Д.П. Филатовым в созданном Н.К. Кольцовым Институте экспериментальной биологии (ИЭБ). Оно, в свою очередь, положило начало многочисленным последующим исследованиям, проводимым на протяжении многих лет в Институте биологии развития им. Н.К. Кольцова и на кафедре эмбриологии биофака МГУ [3]. Регенерация сетчатки и хрусталика у хвостатых амфибий — две важные модели, введенные в исследования в первой половине прошлого столетия. Они позволили раскрыть многие события, которые обусловливают восстановление тканей путем "конверсии клеточного типа" при ограниченном участии малодифферен-цированных клеток. В настоящее время понятно, что регенерация хрусталика и сетчатки у взрослых тритонов является классическим примером восстановления через реализацию репрограммирования генома. Обе эти системы мы рассматриваем ниже в основном в аспекте изучения их молекулярно-генетических механизмов.
Две вторые — модели органной (эпиморфной) регенерации конечности и хвоста у низших позвоночных — привлекали внимание исследователей, так как в их основе лежат не только процессы клеточной дедифференцировки и роста, но и сложные механизмы морфогенеза. В обзоре мы кратко приводим основную, полученную ранее информацию по этим системам и в большей мере останавливаемся на современных достижениях и трудностях изучения молекулярно-генетических механизмов органной регенерации у игоёе1а.
РЕГЕНЕРАЦИЯ СЕТЧАТКИ ГЛАЗА У ХВОСТАТЫХ АМФИБИЙ
После хирургического удаления сетчатки в глазах взрослого тритона происходит образование новой, совершенной сетчатки. Выяснено, что регенерация осуществляется за счет клеток рети-нального пигментного эпителия (РПЭ) в центральной части глаза и малодифференцирован-ных клеток ростовой зоны на его периферии [4—
6]. Определено, что в основе образования сетчатки из клеток РПЭ лежит механизм "трансдиффе-ренцировки", или "конверсии клеточного типа" [7—11]. В основном двумя школами исследователей — японской и российской — изучены различные аспекты этого процесса. Детально исследованы морфология регенерации сетчатки [4—6, 12— 13] и клеточная пролиферация [6, 14—16]. В процессе трансдифференцировки клеток РПЭ в клетки сетчатки проанализированы синтез специфических и общих белков [15, 17], изменения ВКМ [18, 19] и состава цитоскелета [20, 21].
В конце прошлого века стали внедряться методы, позволяющие начать изучение молекулярно-генетических аспектов трансдифференцировки клеток РПЭ и морфогенеза новой сетчатки, исследовать экспрессию и взаимодействие регуля-торных генов [22—27]. В ИБР РАН инициаторами этого нового направления являлись доктора В.И. Миташов и Р.Д. Зиновьева, начавшие исследования в наиболее трудное для российской академической науки время — 90-е годы прошлого века.
Механизм трансдифференцировки РПЭ в клетки сетчатки можно сравнить с индуцированным репрограммированием клеток (подробнее ниже). Однако, начиная со стадии образования из РПЭ нейробластов регенерата сетчатки, механизмы генетического контроля представлялись сходными с таковыми в развитии, а исследования базировались на быстро накапливающихся данных о молекулярных механизмах дифференцировки тканей глаза в онтогенезе. При этом особое внимание уделялось активности т.н. "генов глазного поля", кодирующих транскрипционные факторы, участвующие в определении клеточного фенотипа в развивающемся глазу позвоночных [28].
Для двухэтапного процесса регенерации — формирования зачатка сетчатки из клеток РПЭ и дифференцировки регенерата — наибольший интерес представляли гены, контролирующие: 1) дифференцировку РПЭ (Mitf, tyr, Trp1, Otx2, RPE65, CRBP, CRALBP, Pitx2) и 2) формирование нейробластов и нейрогенез регенерирующей сетчатки (Pax6, Prox1, Six3, Six6, Crx, Chx10, NeuroD, opsin, rhodopsin). Помимо этого интересовали также использующиеся в развитии сигнальные молекулы семейств Fgf, Wnt, Shh, Notch1 (Hes1, Hes5) и гены, кодирующие компоненты этих сигнальных путей. В лаборатории Chiba Ch. в Японии были получены данные о том, что в процессе регенерации сетчатки тритона характер экспрессии генов Otx2, RPE65, CRBP, CRALBP меняется [29]. С использованием метода ПЦР в реальном времени в дедифференцирующихся клетках РПЭ было обнаружено снижение уровня экспрессии генов Otx2, RPE65, контролирующих меланогенез, и возрастание экспрессии регуляторных генов Pax6, Msi-1,
являющихся также ранними маркерами нейраль-ных стволовых клеток [25, 29]. На стадии активной пролиферации клеток и формирования ней-робластов сетчатки начинали экспрессироваться гены Chx10-1, Notch1, Delta, Hes-1, Ngn-1, NCAM. В самом раннем регенерате, состоящем из одно-го-двух рядов клеток, авторы отмечали реэкс-прессию гена RPE65. Это свидетельствовало о начале редифференцировки клеток РПЭ после продукции ими клеток потомков, а также о частичном сохранении в дочерних клетках молекулярных признаков исходной дифференциров-ки [27]. Позже, в развитии транзитной популяции нейробластов, экспрессия генов Pax6, Msi-1, Chx10-1, Hes-1, NCAM сохранялась, но параллельно снижалась экспрессия генов Notch1, Delta, Ngn-1 [29].
В наших исследованиях на взрослых тритонах Pleurodeles waltl, с исполь
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.