научная статья по теме ИССЛЕДОВАНИЕ SEC-СИСТЕМЫ ТРАНСЛОКАЦИИ БЕЛКОВ ПРИ ГЕТЕРОЛОГИЧНОЙ ЭКСПРЕССИИ ГЕНОВ В КЛЕТКАХ БАКТЕРИИ SHEWANELLA ONEIDENSIS MR-1 Химия

Текст научной статьи на тему «ИССЛЕДОВАНИЕ SEC-СИСТЕМЫ ТРАНСЛОКАЦИИ БЕЛКОВ ПРИ ГЕТЕРОЛОГИЧНОЙ ЭКСПРЕССИИ ГЕНОВ В КЛЕТКАХ БАКТЕРИИ SHEWANELLA ONEIDENSIS MR-1»

ПРИКЛАДНАЯ БИОХИМИЯ И МИКРОБИОЛОГИЯ, 2015, том 51, № 3, с. 305-312

УДК 579.222.7+576.34

ИССЛЕДОВАНИЕ Sec-СИСТЕМЫ ТРАНСЛОКАЦИИ БЕЛКОВ ПРИ ГЕТЕРОЛОГИЧНОЙ ЭКСПРЕССИИ ГЕНОВ В КЛЕТКАХ БАКТЕРИИ Shewanella oneidensis MR-1

© 2015 г. Н. Н. Мордкович, Н. А. Окорокова, В. П. Вейко

Институт биохимии им. А.Н. Баха РАН, Москва, 119071 e-mail: vladveiko@yahoo.com Поступила в редакцию 23.10.2014 г.

Проведено сравнение первичных структур белков Sec-системы транслокации белков у бактерий Shewanella oneidensis MR-1 и Escherichia coli. Изучен процесс транслокации рекомбинантных про-энтероксинов (SEB и SEH) из Staphylococcus aureus и про-стрептавидина (SAV) из Streptomyces avidi-nii в периплазму клеток S. oneidensis MR-1 и E. coli. Показано, что эти маркерные белки переносятся в периплазматическое пространство клеток штаммов-трансформантов S. oneidensis MR-1. Установлена идентичность N-концевых аминокислотных последовательностей зрелых рекомбинантных белков SEB, SEH и SAV, образующихся при пост-трансляционном протеолизе лидерного пептида Sec-системой как в E. coli, так и в S. oneidensis MR-1.

Ключевые слова: Sec-система, транслокация белков, S. oneidensis MR-1, E. coli, энтеротоксины, ли-дерный пептид.

DOI: 10.7868/S0555109915030125

Для нормального формирования и функционирования бактериальной клетки необходимо определенное распределение большого количества белков, синтезируемых в цитоплазме, в различных ее компартментах. Для этого белки должны преодолеть гидрофобный барьер плазматической мембраны. Известно, что до 20% всех бактериальных белков частично или полностью локализуются вне ци-топлазматического пространства [1]. К числу таких белков относятся ферменты, секретируемые белки, белки клеточной стенки, компоненты жгутиков, периплазматические белки, белки внешней мембраны у грамотрицательных бактерий и большой спектр таких функциональных трансмембранных белков, как транспортеры, рецепторы, компоненты электрон-транспортной цепи и т.д.

Из-за различия в структуре внешней оболочки грамположительных и грамотрицательных бактерий полипептиды после преодоления цитоплаз-матической мембраны клетки в первом случае поступают во внешнюю среду, а во втором — в периплазматическое пространство [2]. Для секреции белков из периплазматического пространства в окружающую среду необходимо фукционирова-ние дополнительных специализированных систем [3]. Таким образом, на первом и обязательном этапе секреции белков у грамотрицательных бактерий происходит их транслокация в пери-плазматическое пространство клеток. Трансмембранная транслокация белков может обеспечиваться Tat- (Twin arginine translocation) и Sec (Ge-

neral Secretory Pathway, GSP или Sec-pathway)-системами, первая из которых осуществляет транслокацию небольшого количества белков с уже сформированной третичной структурой из цитоплазмы в периплазматическое пространство клетки [4], вторая — секрецию белков в периплазматическое пространство протеобактерий [5]. Интерес к изучению особенностей функционирования Sec-системы транслокации белков определяется ее практической важностью. Пост-трансляционные модификации белков осуществляются в периплазматическом пространстве, поэтому выведение рекомбинантного белка в периплазму позволяет существенно уменьшить воздействие протеаз на него, а также значительно упростить последующее его выделение и очистку [6—9].

В настоящее время протеобактерии вида Shewanella oneidensis MR-1 широко используется в качестве штамма-реципиента для гомо- и гетеро-логичной экспрессии различных генов, при которой можно получить пост-трансляционно модифицированные рекомбинантные белки, в том числе и медицинского назначения (в частности, цитохромы), и определить их структурно-функциональную организацию [10—13].

Одной из особенностей функционирования этой свободноживущей у-протеобактерии является ее высокая электрогенность [14], которая обеспечивается высоким содержанием цитохромов (42 гена, кодирующих цитохромы, тогда как в геноме E. coli таких генов обнаружено всего 7), про-

дуцируемых данным микроорганизмом и локализованных в периплазматическом компартменте клетки [15]. Следует отметить, что созревание ци-тохромов происходит именно в периплазматиче-ском пространстве бактерии, что позволяет предположить наличие у S. oneidensis MR-1 высокоэффективной системы транслокации этих белков в периплазматическое пространство клетки [15—17].

Цель работы — изучение основных компонентов Seo-системы трансмембранной транслокации белков у бактерий S. oneidensis MR-1 и E. coli, а также функционирование этой системы при гете-рологичной экспрессии в клетках S. oneidensis MR-1 модельных про-энтероксинов (SEB и SEH) из Staphylococcus aureus и про-стрептавидина (SAV) из Streptomyces avidinii.

МЕТОДИКА

В работе использовали штаммы E. coli MG1655, JM110 (Всероссийская коллекция промышленных микроорганизмов (ВКПМ) ГосНИИгенетики, Россия) и штамм S. oneidensis MR-1 (№ CIP106686, коллекция микроорганизмов Института Пастера, Франция). Плазмиды, содержащие гены про-эн-теротоксинов B, H (SEB, SEH) и про-стрептави-дина (SAV), были сконструированы ранее [7, 9, 18, 19]. Плазмида pER, содержащая ген устойчивости к канамицину и промотор-операторную область гена udp из E. coli, сконструирована ранее [12]. Плазмида pACYC177 получена из ВКПМ ГосНИИгенетики.

Клетки E. coli культивировали в жидкой или на агаризованной (1.5% агара) среде LB (Лурия— Бертани) при 37°C [20], а клетки S. oneidensis MR-1 — в жидкой или на агаризованной (1.5% агара) среде TSB (Tryptic Soy Broth, ("Sigma", США) при 30°C. Для культивирования 40 г среды TSB добавляли к 1 л дистиллированной воды. Селективный рост клеток-трансформантов обеспечивали канами-цином (50 мкг/мл).

Выделение, очистку, гидролиз эндонуклеаза-ми рестрикции, лигирование фрагментов ДНК и трансформацию клеток E. coli плазмидной ДНК проводили согласно [20]. Трансформацию кле-

Nkm

ток S. oneidensis MR-1 плазмидной ДНК — как описано в [21].

Для проведения иммуноблота белки после разделения электрофорезом в 12.5%-ном ПААГ в денатурирующих условиях переносили на нитро-целлюлозную мембрану с помощью прибора SD Semi-dry Transblotter ("Bio-Rad", США) при плотности тока 1 мА/см в течение 90 мин. В качестве буфера для переноса использовали 48 мМ трис-ОН-буфер, рН 7.2, содержавший 39 мМ глицина, 0.037% ДДС-Na и 20% этанола. После переноса нитроцеллюлозную мембрану инкубировали в 20 мл 10 мМ фосфатного буфера, рН 7.2, содержавшего 137 мМ NaCl, 2 мМ КС1 и 1% БСА (ФСБ, блокирующий буфер) в течение 45 мин при 37°C. Мембрану промывали дистиллированной водой и инкубировали в течение 60—90 мин в 10 мл 10 мМ ФСБ, рН 7.4, содержавшем антитела к His-tag, конъюгированные с пероксидазой хрена (Anti-His-(C-term)-HRP, "Invitrogen", США) в разведении 1/5000. Затем мембрану промывали водой и окрашивали 1%-ным раствором 3,3',5,5'-тет-раметилбензидина (ТМБ, "US Biological", США).

Для получения периплазматической фракции белков клетки культивировали в жидкой среде LB или TSB, как описано выше. Оптическую плотность культуры клеток измеряли при 600 нм (OD600). Клетки осаждали центрифугированием (14 х 103 g), ресуспендировали в охлажденном ли-зирующем буфере (30 мМ Трис-HCl буфере, pH 8.0, содержавшем 1.0 мM ЭДТА, 1.0 мг/мл ли-зоцима и 25% сахарозы), используя 100 мкл буфера на 1.0 мл исходной культуры (3 ед. OD600), и инкубировали на льду в течение 10 мин при перемешивании. Лизат центрифугировали при 14 х х 103 g в течение 10 мин. Супернатант, содержащий компоненты периплазмы, отделяли и хранили при —20°C.

Электрофоретическое разделение белков проводили по Леммли [22]. Белки-маркеры молекулярной массы — Prestained Protein Molecular Weight Marker ("Thermo Scientific", США)

Структуры олигонуклеотидов, использованных в работе (все структуры указаны в направлении 5' — 3'):

CKm CTTGGTCAAGCTTTTAGAAAAACTCATC

NSEH TATGGATCCATGATTAATAAAATTAAAATA

CSEH ATAGTCGACCTAGTGATGATGGTGATGGTGTTTTTTCTTAGTATATA

NSEB TTTGGATCCATGTATAAGAGATTATTTATTTCA

CSEB ATAGTCGACCTAGTGATGATGGTGATGGTG

NSAV CTGGGGATCCATGCGCAAGATCGTCGTTG

CSAV ATAGTCGACCTAGTGATGATGGTGATGGTGCTGCTGAACGGCGT

Таблица 1. Сравнительный анализ первичных структур белков Sec-системы бактерий S. oneidensis MR-1 и E. coli

Белок Функциональная роль белка в клетках E. coli Содержание идентичных аминокислотных остатков в белках из S. oneidensis MR-1 и E. coli, %

SecY Субъединица пре-протеин транслоказы SecYEG, формирование поры в мембране 82

SecE » 50

SecG » 59

SecB Белок экспорта про-белков в транслоказу SecYEG 70

Sec D Компонент гетеротримера SecDFYajC, стимулятора транслокации про-белка 42

Sec F » 40

YajC » 60

FtsY Мембранный рецептор 77

FfH Распознавание лидерного пептида про-белка 77

SecA Субъдиница пре-протеин транслоказы (АТФаза), премещение про-белка через пору SecYEG 77

LepB Сигнальная пептидаза I, отщепление лидерного пептида пробелка 48

Очистку рекомбинантных SEB, SEH и SAV проводили Ni-хелатной хроматографией. Из пе-риплазматической фракции, полученной из ночной культуры клеток E. coli K-12 MG1655 и S. oneidensis MR-1, трансформированных одной из плазмид (pLSEH, pLSEB или pLSAV), осаждали белки сульфатом аммония (80% насыщения). Белки отделяли центрифугированием при 14 х 103 g и растворяли в 25 мМ фосфатном буфере, pH 8.0, содержавшем 0.5 M NaCl и 10 мМ имидазола, наносили на колонку (0.5 х 10 см) с №2+-агарозой ("Qiagen", США) и промывали сначала стартовым буфером, а затем 25 мМ фосфатным буфером, pH 8.0, содержавшем 0.5 M NaCl и 20 мМ имидазола). Белки элюировали тем же буфером с повышенным содержанием имидазола (300 мM). Процесс хроматографии контролировали, измеряя оптическую плотность элюата при 280 нм.

Масс-спектры триптических гидролизатов рекомбинантных белков регистрировали на вре-мяпролетном масс-спектрометре "Ultraflex II BRUKER" (Германия), оснащенном УФ-лазером (Nd), в тандемном режиме работы масс-спектрометра. Погрешность определения масс дочерних ионов не превышала 1 Да. Идентификацию белков осуществляли при помощи программы Mascot (www.matrixscience.com). Анализ проводили в Центре коллективного пользования Инс

Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.

Показать целиком