МИКРОБИОЛОГИЯ, 2013, том 82, № 2, с. 218-227
= ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫЕ СТАТЬИ
УДК 576.8:577:15.081/.082
ИССЛЕДОВАНИЕ СПЕЦИФИЧЕСКОГО ВЗАИМОДЕЙСТВИЯ МИКРОБНЫХ КЛЕТОК С ПОЛИКЛОНАЛЬНЫМИ АНТИТЕЛАМИ ПРИ ПОМОЩИ РЕЗОНАТОРА С ПОПЕРЕЧНЫМ ЭЛЕКТРИЧЕСКИМ ПОЛЕМ
© 2013 г. О. И. Гулий*, 1, Б. Д. Зайцев**, И. Е. Кузнецова**, А. М. Шихабудинов**, Л. Ю. Матора*, С. С. Макарихина*, О. В. Игнатов*
*Институт биохимии и физиологии растений и микроорганизмов Российской академии наук, Саратов **Институтрадиотехники и электроники им. В.А. Котельникова Российской академии наук,
Саратовский филиал, Саратов Поступила в редакцию 23.03.2012 г.
Изучено взаимодействие поликлональных антител с микробными клетками А10$рт11ит Ъгаяйете $р7 с помощью резонатора с поперечным электрическим полем. Для этого получены специфические поликлональные кроличьи антитела на эпитопы О-антигенов штамма А. Ъгаяйете $р7 и показана возможность их применения для детекции микробных клеток с помощью пьезоэлектрического резонатора с поперечным электрическим полем. Установлено, что частотные зависимости реальной и мнимой частей электрического импеданса такого резонатора, нагруженного суспензией клеток А. ЪгаяИете $р7 с антителами, значительно отличаются от зависимостей резонатора с контрольной суспензией клеток без антител. Показано, что полученные антитела взаимодействуют с клетками азоспириллы, причем скопление маркера происходит по всей поверхности клетки. Найден предел возможного определения микробных клеток при их взаимодействии с антителами, который составляет 104 кл/мл. Установлено, что детекция клеток А. Ъгаяйете $р7 с помощью антител возможна в присутствии посторонних бактерий. Представленные результаты демонстрируют возможность регистрации взаимодействия микробных клеток с антителами и разработки биологического датчика для количественной детекции микроорганизмов.
Ключевые слова: детекция, А105рт11ит Ъгаяйете $р7, антитела, пьезоэлектрический резонатор с поперечным электрическим полем.
DOI: 10.7868/S0026365613020055
Одной из проблем современной микробиологии является изучение взаимодействия антител с поверхностью микробной клетки. Взаимодействия антиген-антитело широко применяются в сенсорных системах для детектирования различных видов микроорганизмов [1—3]. В последние годы возрос интерес к применению пьезоэлектрических резонаторов с поперечным электрическим полем для исследования свойств различных жидкостей, включая и биологические. В отличие от традиционных резонаторов с продольным полем они более чувствительны к контактирующей жидкости, поскольку реагируют как на изменение ее вязкости, так и проводимости. Ранее была показана возможность детекции микробных клеток Escherichia coli O157:H7 в суспензии при нанесении на поверхность резонатора пленки, иммо-
1 Автор для корреспонденции (e-mail: guliy_olga@mail.ru).
билизующей соответствующие антитела [4]. Описано использование акустических сенсоров для детекции Salmonella typhimurium с применением бактериофагов [5].
Целью данной работы являлось исследование возможности детекции взаимодействия микробных клеток с антителами на примере A. brasilense Sp7 с помощью резонатора с поперечным электрическим полем.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
Микроорганизмы. В работе использовали бактериальные клетки Azospirillum brasilense Sp7 и Es-cherihia coli BL-Ril, полученные из коллекции микроорганизмов ИБФРМ РАН.
Культивирование микроорганизмов. Суточную культуру A. brasilense Sp7 получали путем засева
клеток с чашки Петри в колбу с жидкой LB средой следующего состава (г/л): NaCl — 10; дрожжевой экстракт — 5; пептон — 5. Инкубирование клеток осуществляли на круговом шейкере при интенсивности перемешивания 160 об./мин при 30°С в течение 18—20 ч. Бактерии хранили на чашках Петри с твердой агаризованной средой.
Бактерии E. coli BL-Ril выращивали в жидкой питательной среде LB в колбах в аэробных условиях на круговом шейкере (160 об./мин) при температуре 30°С в течение 24 ч. Бактерии хранили на чашках Петри с твердой агаризованной средой.
Антитела на соматический антиген A. brasilense Sp7 получали как описано ранее [6].
Подготовка клеток к электроакустическому анализу. Перед проведением анализа клетки отмывали в дистиллированной воде трехкратным центрифугированием при 2800 g в течение 5 мин, затем ресуспендировали в небольшом объеме воды (электропроводность 1.8 мкСм/см). Оптическую плотность подготовленной бактериальной суспензии доводили до значений OD660 = 0.4—0.42.
Проведение анализа с помощью электроакустического датчика. Все эксперименты по изучению изменений механических и электрических свойств клеточных суспензий при биоспецифическом взаимодействии микроорганизмов с антителами проводили с помощью специально изготовленного датчика на основе пьезоэлектрического резонатора с поперечным электрическим полем в диапазоне частот 6—7 МГц. Этот резонатор был изготовлен из пластины ниобата лития X-среза толщиной 0.5 мм. На нижней стороне пластины были помещены два прямоугольных электрода размерами 5 х 10 мм с зазором между ними 3 мм. Область вокруг электродов и часть электродов были покрыты специальным лаком, который демпфировал паразитные волны Лэмба [7] и обеспечивал достаточно высокую добротность ~630. На верхней стороне пластины была приклеена жидкостная ячейка объемом ~1 мл.
Для проведения анализа подготовленные микробные клетки без добавления антител и при добавлении специфических антител вносили в вышеупомянутую жидкостную ячейку и проводили измерения реальной и мнимой частей электрического импеданса датчика с помощью прецизионного измерителя LCR параметров Agilent 4285A.
Электронная микроскопия. Для электронно-микроскопической идентификации взаимодействия клетокA. brasilense Sp7 с антителами готовили препараты с концентрацией клеток 106 кл/мл, за-
тем инкубировали 0.5 мл суспензии микроорганизмов в забуференном физиологическом растворе (ЗФР) с 10 мкл раствора гомологичных АТ с концентрацией 100 мкг/мл в течение 1 ч на шейкере. После этого центрифугировали суспензию при 12000 g 5 мин и ресуспендировали осадок клеток в 0.5 мл ЗФР. Затем суспензию инкубировали со 100 мкл раствора маркера протеин А + коллоидное золото (OD520 = 0.5) в течение 1 ч, после чего повторяли операции осаждения и ресуспендиро-вания. Приблизительно 20 мкл суспензии наносили на пленку ("Parafilm", США) и помещали каплю на никелевую сеточку (200 меш) с нитро-целлюлозной подложкой, укрепленной углеродом, на 20 мин. Осуществляли тепловое прикрепление, удерживая сеточку около лампы накаливания 2 мин. Излишек жидкости удаляли, прикасаясь сеточкой к полоске фильтровальной бумаги. Сеточку промывали в капле деионизованной воды, высушивали и помещали в контейнер. Анализ проводили с помощью электронного микроскопа Libra 120 (Германия).
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
Среди основных антигенов бактериальной поверхности азоспирилл как грамотрицательных микроорганизмов особый интерес представляет липополисахарид или О-антиген. Строение его О-специфического полисахарида определяет им-мунохимическую специфичность микроорганизмов, что служит основой для их внутривидовой классификации.
Мы исследовали изменения физических параметров суспензии клеток A. brasilense Sp7 при взаимодействии с О-специфическими антителами при помощи электроакустического датчика при разных концентрациях клеток в суспензии. Для этого проводили измерения частотных зависимостей реальной и мнимой частей электрического импеданса, когда в жидкостной ячейке находятся микробные клетки A. brasilense Sp7 без добавления антител и при добавлении специфических антител. В наших экспериментах исследовали суспензии при количестве клеток в ячейке 102, 104, 106, и 108 кл/мл. Концентрация антител составляла 3.2 мкг/мл. Выбор данной концентрации обусловлен тем, что ранее нами были проведены исследования по изучению изменения электрооптических параметров суспензии клеток A. brasilense Sp7 при воздействии специфических антител и показано, что максимальные изменения величины электрооптического параметра суспензии клеток фиксируются при внесении в
/, мГц
X, Ом (б) /, мГц
6.04 6.14 6.24 6.34 6.44 6.54 6.64 6.74
Рис. 1. Зависимость реальной (а) и мнимой (б) части электрического импеданса от частоты (количество клеток в ячейке 102 кл/мл) при взаимодействии клеток А. ЬгаяНете 8р7 с антителами. 1 — дистиллированная вода; 2 — суспензия клеток A. brasilense 8р7 без добавления антител; 3 — суспензия клеток A. brasilense 8р7 с добавлением антител.
суспензию клеток антител до конечной концентрации 3.2 мкг/мл [8].
На рис. 1—4 представлены измеренные частотные зависимости действительной (а) и мнимой (б) частей электрического импеданса датчика для чистой суспензии клеток с концентрациями 102, 104, 106, и 108 кл/мл, соответственно, и после их
взаимодействия с антителами. Здесь же для сравнения представлены указанные зависимости для дистиллированной воды. Эти зависимости позволяют сделать следующие выводы.
Во-первых, видно, что датчик позволяет четко разграничивать ситуации, когда происходит взаимодействие бактериальных клеток со специфиче-
Я, Ом (а)
2000
1500
1000 -
500 -
6.04 6.14 6.24 6.34 6.44 6.54 6.64 6.74 6.84 6.94 7.04
/, мГц
X, Ом (б) /, мГц
6.04 6.14 6.24 6.34 6.44 6.54 6.64 6.74 -1500
2000 2500 3000 3500 4000 4500 5000 5500 6000
3
Рис. 2. Зависимость реальной (а) и мнимой (б) части электрического импеданса от частоты (количество клеток в ячейке 104 кл/мл) при взаимодействии клеток А. ЬгаяНете 8р7 с антителами. Обозначения как на рис. 1.
скими антителами, от контрольных экспериментов, когда такое взаимодействие отсутствует. Во-вторых, указанные зависимости показывают возможность использования в качестве аналитического сигнала значение действительной или мнимой части электрического импеданса на фиксированной частоте. Из рисунков видно, что значение фиксированной частоты можно выбирать произвольно в некоторой окрестности вблизи резонансной частоты. На рис. 5 представлены зави-
симости изменения реальной (а) и мнимой (б) значений частей импеданса в результате взаимодействия клеток с антителами от ко
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.