ПРИКЛАДНАЯ БИОХИМИЯ И МИКРОБИОЛОГИЯ, 2015, том 51, № 6, с. 561-569
УДК 579.222.7+576.34
ИССЛЕДОВАНИЕ СТРУКТУРНО-ФУНКЦИОНАЛЬНОЙ ОРГАНИЗАЦИИ СИГНАЛЬНОГО ПЕПТИДА ПРО-ЭНТЕРОТОКСИНА В ИЗ Staphylococcus aureus
© 2015 г. Н. Н. Мордкович, Н. А. Окорокова, В. П. Вейко
Институт биохимии им. А.Н. Баха РАН, Москва, 119071 e-mail: vladveiko@yahoo.com Поступила в редакцию 20.04.2015 г.
Сконструирована серия генов про-энтеротоксина В из Staphylococcus aureus, содержащих мутантные формы сигнального пептида и исследована функциональная роль введенных мутаций. Показано, что внесенная протяженная мутация n-района сигнального пептида, в отличие от аналогичной мутации h-района, не влияла на эффективность секреции про-энтеротоксина В. Получены точечные мутации сигнального пептида про-белка, включающие N-концевой аминокислотный остаток зрелого белка. Показано, что введенные структурные изменения приводят к снижению эффективности секреции и перераспределению белка в составе различных компартментов клеток Escherichia coli.
Ключевые слова: Sec-система, транслокация белков, Staphylococcus aureus, E. coli, энтеротоксин В, лидерный пептид, сайт-направленный мутагенез.
DOI: 10.7868/S0555109915060100
Нормальное формирование и функционирование бактериальных клеток предполагает не только синтез различных белков, который происходит в цитоплазматическом пространстве микроорганизмов, но и их локализацию в отдельных компартмен-тах клетки, где они выполняют свои специфические функции. При этом частично или полностью вне цитоплазматического пространства клетки находится до 25—30% от общего количества бактериальных белков [1]. К числу таких белков могут быть отнесены белки внешней клеточной мембраны, транспортной системы, ферменты, токсины компоненты жгутиков, рецепторы, белки электрон-транспортных цепей и т.д., распределение которых внутри бактериальных клеток осуществляется, по крайней мере, 16 различными секреторными системами [1].
Особенности строения внешней оболочки у грамположительных и грамотрицательных бактерий определяют дальнейшее, после преодоления полипептидом цитоплазматической мембраны, перемещение белков: в первом случае они поступают во внешнюю среду, а во втором — в периплаз-матическое пространство. Секреция полипептидов в окружающую клетку среду требует участия дополнительных специализированных систем транслокации [2—4] и имеет свои особенности у грамотрица-тельных бактерий Следует отметить, что первым и во многом решающим этапом в секреции белков у грамотрицательных бактерий, является преодоление внутренней мембраны, отделяющей периплаз-
матическое и цитоплазматическое пространства этих бактерий.
Трансмембранная транслокация полипептидов в клетках грамотрицательных бактерий осуществляется внутриклеточными системами, представляющими собой мультимерные белковые комплексы [1]. Эти системы подразделяются на два типа: Tat-(Twin Arginine Translocation) и Sec- (General Secretory Pathway, Sec-pathway) системы, специализирующиеся на трансмембранном переносе белков с уже сформированной и несформированной третичной структурой, соответственно. В настоящее время идентифицированы все основные белки, участвующие в указанных системах транслокации и определена функция каждого из них, что достаточно полно представлено в обзорах [5—8].
Для практических целей в биотехнологических процессах, направленных на получение рекомби-нантных белков, чаще используется Sec-система транслокации полипептидов. Этому есть два объяснения: данный механизм транслокации обладает большей "пропускной способностью" по сравнению с Tat-системой [9] и, кроме того, процессы синтеза про-белка и его Sec-транслокация являются сопряженными, т.е. время контакта растущей цепи белка с внутриклеточными протеазами минимально, что позволяет избежать непрогнозируемого гидролиза рекомбинантных белков [10—14]. Однако в последние годы исследователи стали обращать пристальное внимание и на примене-
ние Tat-системы при получении гетерологичных рекомбинантных белков [15].
К настоящему времени в меньшей степени изучена роль первичной структуры сигнального пептида (лидерного пептида) в эффективности протекания транслокации полипептидной цепи c участием Sec-системы. На основании анализа аминокислотных последовательностей лидерных пептидов про-белков у прокариот, было установлено, что они включают в среднем 25—30 а.о. [16], и состоят из 3 различающихся по своим свойствам участков: положительно заряженного N-концевого фрагмента (n-район), гидрофобного кора (h-район) и полярного С-концевого участка (c-район), включающего сайт отщепления про-пептида сигнальной пептидазой I типа (SPasel). Эти особенности первичной структуры сигнальных пептидов и успехи в секвенировании геномов различных организмов позволили разработать достаточно эффективные компьютерные программы по идентификации сигнальных последовательностей в про-белках и предсказать локализацию соответствующих зрелых полипептидов в клетках [17—19, http:// proline.bic.nus.edu.eg/spdb, SignalBLAST www.csbio.sjtu.edu.cn/bioinf/Signal-3L/, SignalP www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/]. Немаловажным было и обнаружение особенности первичной структуры сигнальных пептидов (субстратов SPasel), заключающейся в преимущественном расположении аминокислотных остатков (а.о.) с малым боковым радикалом в координатах — 3(Р3) и —1(Р1) по отношению к сайту протеолиза, что было обозначено как "Ala-X-Ala''-правило, по названию а.о., наиболее часто встречающегося в этих положениях структуры сигнального пептида [20]. Позже в рассмотрение был включен и а.о. +1 (первый аминокислотный остаток зрелого белка), позволяющий более точно локализовать лидер-ный пептид в структуре про-белка [17].
Однако первичные структуры лидерных пептидов у про-белков бактерий имеют значительные различия, которые могут существенно влиять на эффективность транслокации зрелых полипептидов у различных бактерий. Это влияние может усиливаться, если учесть, что в Sec-секретор-ном процессе на различных его этапах принимает участие большая группа белков, отвечающая за различные стадии переноса про-белков (SRP, FtsY, SecA, SecB, SecY, SecE, SecG, LepB и др.) [2, 5], которые, несмотря на высокую гомологичность, имеют у различных бактерий также значительное количество аминокислотных замен [21]. Многие эубактерии, включая E. coli, а также дрожжи и ар-хеи имеют одну сигнальную пептидазу первого типа (SPasel, LepB), обеспечивающую отщепление лидерного пептида, в то время как большинство эукариот — 2. Особое место в этом ряду занимает Bacillus subtilis, продуцирующая 5 пара-логичных SPasel, что, по-видимому, связано с
обеспечением секреции большого количества секретируемых белков [22]. Таким образом, эффективная Seo-система транслокации про-бел-ков у бактерий сформирована и определяется двумя неоднородными по первичной структуре у различных бактерий компонентами — сигнальным пептидом предшественника зрелого белка и функциональными белками, формирующими саму транслокационную систему. Возможно, что именно эти различия в первичных структурах ли-дерных пептидов про-белков и белков Seo-систе-мы у различных бактерий и определяют как саму возможность, так и эффективность транслокации предшественников белков в клетках различных бактерий [21].
Цель работы — исследование влияния структурной организации сигнального пептида про-энтеротоксина В (pro-SEB) из Staphylococcus aureus на локализацию зрелого белка при гетероло-гичной экспрессии его гена (entB) в клетках E. coli с неповрежденной функционирующей системой трансмембранной транслокации белков (штамм E. coli K-12 MG1655).
МЕТОДИКА
В работе использовали штаммы E. coli MG1655, JM110 (Всероссийская коллекция промышленных микроорганизмов (ВКПМ) ГосНИИгенети-ки, Россия). Плазмида, содержащая ген про-эн-теротоксина B (SEB) под контролем промотор-операторной области гена уридинфосфорилазы E. coli, была сконструирована и модифицирована введением фрагмента ДНК, кодирующего 6 остатков гистидина на С-конце белка в нашей лаборатории ранее [21, 23]. Клетки E. coli культивировали в жидкой или на агаризованной (1.5% агара) среде LB (Лурия-Бертани) при 37°C [24].
Выделение, очистку, гидролиз эндонуклеаза-ми рестрикции, лигирование фрагментов ДНК и трансформацию клеток E. coli плазмидной ДНК проводили согласно [24]. Внесение точечных мутаций в состав ДНК осуществляли согласно [25], а протяженные замены — по ранее отработанной нами методике, описанной в работе [26].
Электрофоретическое разделение белков проводили по Леммли [27]. Белки-маркеры молекулярной массы — Prestained Protein Molecular Weight Marker ("Thermo Scientific", США).
Для проведения иммуноблота белки после разделения методом электрофореза в 12.5%-ном ПААГ в денатурирующих условиях переносили на нит-роцеллюлозную мембрану с помощью прибора SD Semi-dry Transblotter ("Bio-Rad", США) при плотности тока 1 мА/см в течение 90 мин. В качестве буфера для переноса использовали 48 мМ трис-ОН-буфер, рН 7.2, содержащий 39 мМ глицина, 0.037% ДДС-Na и 20% этанола. После переноса нитроцеллюлозную мембрану инкубирова-
Таблица 1. Структура использованных олигонуклеотидных праймеров
Название Структура 5'—3'
E28R+ AGCAAGGAGTCAACCAGATCCT
E28R- CTGGTTGACTCCTTGCTAAAAC
E28D+ AGCAGATAGTCAACCAGATCCT
E28D- CTGGTTGACTATCTGCTAAAAC
E28Q+ AGCACAAAGTCAACCAGATCCT
E28Q- CTGGTTGACTTTGTGCTAAAAC
E28G+ AGCAGGTAGTCAACCAGATCCT
E28G- CTGGTTGACTACCTGCTAAAAC
E28T+ AGCAACTAGTCAACCAGATCCT
E28T- CTGGTTGACTAGTTGCTAAAAC
E28L+ AGCATTGAGTCAACCAGATCCT
E28L- CTGGTTGACTCAATGCTAAAAC
N24F- TGCTAAAACGAAGGGTGTAGA
N24F+ TCTACACCCTTCGTTTTAGCA
D3+ ATTAGTTATTAACGTTTTAGCAGAGAGTC
D3- GCTAAAACGTTAATAACTAATATCAGTGCGA
NDmut TTTGGATCCATGATAAGAGATTATTTATTTCACATGTATATTTTG
CDmut+ TTTGATATTCGCACTGATATTAGTTATTTCTACACCCATAACG
CDmut- ATGGGTGTAGAAATAACTAATATCAGTGCGAATATCAAATACATG
ли в 20 мл 10 мМ фосфатного буфера, рН 7.2, содержащего 137 мМ NaCl, 2 мМ KCl и 1% БСА (ФСБ, блокирующий буфер) в течение 45 мин при 37°C. Мембрану промывали дистиллированной водой и инкубировали в течение 60—90 мин в 10 мл 10 мМ ФСБ, рН 7.4, содержащем антитела к His-tag, конъ
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.