= КЛЕТОЧНАЯ РАДИОБИОЛОГИЯ =
УДК [57+61]::539.1.04:614.875:599.89:612.112.94
ИССЛЕДОВАНИЕ СТРУКТУРНО-ФУНКЦИОНАЛЬНЫХ ПРИЗНАКОВ (ИНДИКАТОРОВ) АПОПТОЗА ЛИМФОЦИТОВ КРОВИ ЧЕЛОВЕКА В УСЛОВИЯХ ВОЗДЕЙСТВИЯ МОНООКСИДА УГЛЕРОДА И УЛЬТРАФИОЛЕТОВОГО (УФ)-СВЕТА © 2014 г. В. Г. Артюхов1, *, О. В. Путинцева1, О. И. Бахметьева1, С. М. Костенко2, С. М. Дубова1
воронежский государственный университет 2Воронежский областной центр по профилактике и борьбе со СПИДом и инфекционными заболеваниями, Воронеж
Исследованы изменения выраженности экспрессии мембранного СБ95-рецептора, структурного состояния ДНК, параметров биохемилюминесценции лимфоцитов крови человека в условиях воздействия монооксида углерода (60—90 мин) и УФ-света (240—390 нм) в дозах 151, 453 и 755 Дж/м2. Выявлено падение уровня экспрессии Ба8-маркеров на поверхности иммуноцитов после инкубации в атмосфере СО (60—90 мин), отсутствие изменений в структуре ДНК и уменьшение интенсивности протекания процессов пероксидного окисления липидов в изучаемых клетках. Установлено, что УФ-свет (151—755 Дж/м2) проявляет проапоптотическое действие, о чем свидетельствует повышение выраженности экспрессии СБ95-рецепторов на поверхности лимфоцитов периферической крови человека, снижение электрофоретической подвижности ДНК УФ-облученных клеток. Однако процесс программируемой клеточной гибели не протекает ("апоптозная лестница" на электро-фореграммах в условиях эксперимента отсутствует). Показано, что сочетанное действие монооксида углерода и УФ-света на лимфоциты крови человека приводит к снижению чувствительности мембранных СБ95-рецепторов к воздействию УФ-излучения. Выявлено, что монооксид углерода может вносить вклад в блокирование процессов пероксидного окисления липидов (ПОЛ) и, как следствие, активировать антиоксидантные свойства клетки. Сделано заключение, что молекула СО в физиологических концентрациях, вероятно, оказывает антиапоптотический эффект по отношению к лимфоцитарным клеткам.
Лимфоциты, монооксид углерода, УФ-свет, апоптоз, СБ95-рецепторы, ДНК, параметры биохемилю-минесценции.
Б01: 10.7868/80869803114030047
Среди агентов, использующихся для выяснения процессов биорегуляции, широкое применение нашло УФ-излучение. Последнее выступает в качестве тонкого инструмента, позволяющего исследовать молекулярные основы гомеостатиче-ских процессов организма. Однако УФ-свет известен как потенциальный индуктор апоптоза в различных типах клеток, в том числе и лимфоидного ряда [1-3].
В настоящее время пристальное внимание исследователей направлено на изучение и анализ реализации процессов программируемой клеточной гибели (ПКГ) и установление молекулярных механизмов ее дизрегуляции. В норме данный процесс необходим для поддержания тканевого гомеостаза за счет устранения избыточных и функционально неполноценных клеток, нормального развития
* Адресат для корреспонденции: 394006 Воронеж, Университетская пл., 1, ВГУ; тел.: (473) 220-89-81; (473) 220-85-86; факс: (473) 220-83-08; e-mail: avg@main.vsu.ru.
нервной и регуляции активности иммунной систем. Нарушение протекания ПКГ является важным фактором, способствующим развитию различных заболеваний организма [4].
Иммунная система, ответственная за поддержание антигенного постоянства, включает большое количество составляющих, одно из центральных мест среди которых занимают лимфоцитар-ные клетки. Выполнение ими специфических функций невозможно без осуществления коммуникации с другими клетками организма. Одним из способов передачи информации является диффузия сигнальных молекул летучих неорганических соединений (нейротрансмиттеров-газотрансмит-теров) по межклеточному пространству и их действие на рецепторы клеток-мишеней.
Среди газотрансмиттеров особый интерес представляет СО (оксид углерода (II), монооксид углерода, угарный газ). В настоящее время точно установлено, что представления о СО только как
о токсическом и смертельно опасном для организма человека соединении устарели. В норме в организме человека оксид углерода (II) образуется при деградации гемсодержащих соединений [5]. Сейчас доказано, что СО в низких концентрациях, наравне с N0, необходим для функционирования практически всех органов и тканей. Монооксид углерода вовлечен в регуляцию иммунных процессов, тонуса сосудов, передачу импульсов в головном мозгу, он ингибирует в тканях провоспалительные сигнальные пути и способствует индукции антипролиферативных и ан-тикоагуляционных механизмов [6].
Однако, несмотря на вышесказанное, на сегодняшний день остается нерешенным вопрос об участии СО в молекулярных механизмах регуляции апоптоза клеток. Известно, что монооксид углерода обладает дуалистическим эффектом в отношении апоптотической реакции клеток. При этом конечный эффект воздействия газового мес-сенджера на апоптоз определяется не только типом исследуемых клеток, но и концентрацией, и временем воздействия СО на них [7].
В связи с вышеизложенным нами было исследовано собственное монооксида углерода и соче-танное влияние его с УФ-излучением (240—390 нм) в дозах 151, 453 и 755 Дж/м2 на состояние показателей — индикаторов апоптоза лимфоцитов крови человека.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДИКА
Объектами исследования служили лимфоциты, полученные из гепаринизированной периферической крови человека.
Выделение лимфоцитов из донорской крови осуществляли седиментацией (центрифугированием при 300 §, 15 мин) в градиенте плотности фиколл-урографина (р = 1.077 г/см3) по методу А. Воуиш [8].
Суспензию лимфоцитарных клеток помещали в атмосферу оксида углерода (II), который получали лабораторным способом по химической реакции между концентрированными серной и муравьиной кислотами в колбе с закрытой крышкой и газоотводной трубкой [9]. Эти кислоты смешивали в соотношении 1 : 1. Воздействие монооксидом углерода на исследуемые клетки крови длилось 60, 75 и 90 мин.
Количество образовавшегося оксида углерода (II) определяли спектрофотометрическим методом [10] по содержанию карбоксигемоглобина в гепаринизированной крови доноров. Оптическую плотность растворов карбоксигемоглобина человека измеряли при X = 538 и 550 нм с помо-
щью спектрофотометра "Shimadzu RF-5301 РС" (Япония). Исходная концентрация HbCO в на-тивной крови составила 0.3%, а после 60 мин пропускания СО через ее образец она достигла значения 0.6%, через 75 мин — 0.8%, через 90 мин — 0.9%, что соответствует 0.002; 0.004; 0.005 и
0.006 мг/л HbCO соответственно. Таким образом, используемые для модификации исследуемых клеток концентрации СО не превышали физиологического уровня содержания этого лиганда в крови здоровых лиц [11].
Суспензии нативных и СО-модифицирован-ных иммуноцитов в объеме 1 мл подвергали воздействию УФ-излучения, источником которого служила ртутно-кварцевая лампа типа "ДРТ-400" (Россия). В работе использовали светофильтр УФС-1 с полосой пропускания 240—390 нм (со спектральными линиями 253.7, 265.2, 280.0, 296.7, 302.2, 312.6, и 365.0 нм). Опытные образцы облучали сверху в стеклянной термостатируемой кювете (при 37 ± 1°С) в условиях непрерывного перемешивания магнитной мешалкой. Расстояние от оси лампы до кюветы с суспензией клеток составляло 0.23 м. Интенсивность излучения лампы — 151 Дж/м2 в 1 мин. Время воздействия УФ-света на суспензию лимфоцитов составляло
1, 3 и 5 мин (соответственно дозы облучения равнялись 151, 453 и 755 Дж/м2).
Уровень экспрессии СВ95-рецепторов на поверхности нативных и СО-модифицированных мембран лимфоцитов крови человека (2 х 106 кл/мл) до и после воздействия УФ-света определяли на проточном цитофлуориметре "EPICS XL-MCE' ("Beckman coulter", США). В работе использовали монокло-нальные антитела к CD95, меченные Fluorescein Isothiocyanate (FITC) и соответствующие изотипиче-ские контроли ("Beckman coulter", США).
Выделение ДНК из нативных и модифицированных монооксидом углерода и УФ-светом лимфоцитов (2 х 106 кл/мл) проводили с использованием набора "ДНК-сорб-В" в соответствии с протоколом фирмы-производителя ("Amplisens", ФГУН "ЦНИИЭ", Россия). Изменения структуры ДНК иммуноцитов анализировали с помощью метода электрофореза в 2%-ном агарозном геле с использованием ТАЕ-буфера (рН = 8) [12]. Размеры фрагментов ДНК (число п.н. — пар нуклео-тидов) иммунокомпетентных клеток при проведении электрофореза в агарозном геле определяли с помощью Mass Ruller™ ДНК-маркера ("Fermentas", США). Электрофоретическую подвижность фракций ДНК лимфоцитов рассчитывали с помощью флуоресцентной линейки УФ-прозрачного лотка геля, используемого при постановке эксперимента.
Об интенсивности процессов пероксидного окисления липидов нативных и СО-модифици-рованных лимфоцитов (5 х 105 кл/мл) до и после воздействия УФ-излучения судили по интенсивности спонтанной (нестимулированной) люми-нол-зависимой хемилюминесценции [13]. Регистрацию ее параметров проводили в течение 60 с на биохемилюминометре "БХЛ-06М" (Россия), оценивая максимальную интенсивность и свето-сумму хемилюминесценции исследуемых образцов лимфоцитов.
Для статистической обработки результатов экспериментов использовали прикладную программу Microsoft Exel: определяли среднее значение показателей, стандартное отклонение и доверительный интервал. Достоверность различий контрольных и опытных значений сравниваемых показателей рассчитывали по í-критерию Стью-дента при 5%-ном уровне значимости вероятности ошибки.
РЕЗУЛЬТАТЫ
С целью выяснения возможности реализации Fas-зависимого пути апоптоза лимфоцитов в условиях воздействия монооксида углерода и УФ-света было исследовано изменение выраженности экспрессии CD95 (Fas-) рецепторов.
Цитометрические исследования суспензий интактных лимфоцитов показали, что содержание CD95+-клеток составляло 36.0 ± 3.1%, а их средняя интенсивность флуоресценции (СИФ) — 3.0 ± 0.2 усл. ед.
После воздействия на смесь иммуноцитов монооксида углерода в течение 60, 75 и 90 мин СИФ клеток понижалась соответственно на 13.6; 25.2 и 27.5% (рис. 1).
Облучение лимфоцитов УФ-светом в дозе 151 Дж/м2 не приводило к статистически значимым изменениям выраженности экспрессии CD95 маркеров. УФ-излучение в дозах 453 и 755 Дж/м2 вызывало повышение тестируемо
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.