ПРИКЛАДНАЯ БИОХИМИЯ И МИКРОБИОЛОГИЯ, 2014, том 50, № 4, с. 442-448
УДК 543.5;547.96;577.112.5
ИССЛЕДОВАНИЕ СТРУКТУРЫ БИОРЕГУЛЯТОРА, ВЫДЕЛЕННОГО ИЗ ГОЛОВНОГО МОЗГА КРЫС
© 2014 г. А. П. Ильина*, А. А. Молявка*, В. П. Ямскова**, А. К. Буряк***, И. А. Ямсков*
*Институт элементоорганических соединений им. А.Н. Несмеянова РАН, Москва, 119991
e-mail: Yamskov@mail.ru **Институт биологии развития им. Н.К. Кольцова РАН, Москва, 119334 e-mail: Yamskova-vp@yandex.ru **Институт физической химии и электрохимии им. А.Н. Фрумкина РАН, Москва, 119991
e-mail: AKBuryak@ipc.rssi.ru Поступила в редакцию 22.10.2013 г.
Из ткани мозга крысы линии Wistar выделен биорегулятор, действующий в сверхмалых дозах. С помощью метода ВЭЖХ в обращенной фазе получен гомогенный полипептид c молекулярной массой 4749 ± 2 Да, который отвечает за проявление биологической активности биорегулятора. Методами КД-спектроскопии рассчитано процентное содержание канонических элементов вторичной структуры полипептида в растворе. Методами протеомных исследований установлено, что структура изученного полипептида идентична N-концевой последовательности фрагмента гуанин-нуклеотидсвязываю-щего Оо-белка (субъединица а-1).
DOI: 10.7868/S0555109914030234
Как известно, основной функцией миелина является быстрая передача нервного импульса по аксону, при демиелинизации которого происходит снижение скорости проведения потенциала действия и десинхронизация нейрональной активности [1—3]. На электрофизиологическом уровне процесс демиелинизации сопровождается изменениями скорости проведения потенциала действия и его амплитуды, активности быстрых К+-каналов, а также частот оптимального и максимального ритма [4, 5]. Демиелинизация нервного волокна сопровождается снижением содержания миелина в интернодальной области, что проявляется в активации дополнительных К+-каналов, а также изменении активности электрогенного №+-на-соса в "оголенных" участках нерва. Кроме того, накопление лизоформ ряда фосфолипидов и нарушение Са2+-гомеостаза внутренних отделов миелина (насечки Шмидта—Лантермана, мезак-сон и т.д.) при проведении ритмического возбуждения сопровождается ослаблением аксоглиаль-ных взаимодействий за счет нарушения структуры внеклеточного матрикса.
Ранее нами было показано, что биорегулятор, выделенный из мозга крыс, существенным образом влиял как на скорость проведения, так и величину потенциала действия при ритмическом возбуждении в демиелинизированном нервном волокне [6]. Важно, что эти процессы зависели от режима ритмического возбуждения. При функционировании нервного волокна в оптимальном
режиме (50 Гц) этот биорегулятор способствовал замедлению снижения скорости проведения потенциала действия, а в максимальном режиме (100 Гц) — его амплитуды. Было высказано предположение о том, что, проникая в разрушенные области миелина, биорегулятор вызывает не только изменение состояния воды и объема мезаксона и насечек, но и перераспределение связанного Са2+ и заряда фосфолипидов, что увеличивает плотность миелина и соответственно скорость потенциала действия по нервному волокну [6].
Биорегулятор, выделенный из мозга крыс, является представителем группы мембранотропных гомеостатических тканеспецифических биорегуляторов (МГТБ), которые были обнаружены в тканях животных, растений и у микроскопических грибов [7]. МГТБ оказывают влияние на важнейшие биологические процессы, а именно, на миграцию и адгезию клеток, клеточную пролиферацию, дифференцировку, увеличивают жизнеспособность клеток при культивировании. Они локализованы во внеклеточном пространстве, а их активность характеризуется наличием тканевой, но отсутствием видовой специфичности [8—11]. МГТБ стимулируют репаративные процессы в патологически измененных тканях, способствуют восстановлению их нарушенной структуры за счет дополнительной активации клеточных источников регенерации [12, 13]. МГТБ имеют сложный состав. Наиболее изучена белковая компонента биорегуляторов данной группы, которые представляют собой пептиды (молекулярные
массы 1—8 кДа), ответственные за их функциональную активность, а также белки-модуляторы, оказывающие влияние на биологическое действие пептидов и взаимодействующие с ними по Са+2-связывающему механизму [7, 8, 10, 14].
Цель работы — выделение и изучение биорегулятора из ткани мозга крыс, а также определение первичной и вторичной структуры его биологически активного пептидного компонента [7].
МЕТОДИКА
Выделение и очистка биорегулятора. Исследование проводили на крысах линии Wistar, обоего пола, массой 180—250 г, содержащихся в виварии Института биологии развития им. Н.К. Кольцова РАН. После декапитации животных под эфирным наркозом мозг извлекали, его фрагменты размером 1—1.5 см выдерживали в водно-солевом растворе состава: 0.15 М NaCl, 1.0 мМ CaCl2, 1.0 мМ Hepes (рН 7.0-7.2) в течение 3 ч при 4°С. Экстракт центрифугировали при 3000 g в течение 30 мин. Надосадочную жидкость собирали, добавляли ЭДТА до достижения его концентрации 10-2 М и осаждали белки сернокислым аммонием (около 70% насыщения) в течение 90 ч при 4°С. Образовавшуюся суспензию центрифугировали (15000 g; 45 мин), супернатант и осадок собирали отдельно, диализовали против воды до полного удаления следов соли. Супернатант концентрировали на вакуумном роторном испарителе при 40°С. В обеих фракциях оценивали мембрано-тропную активность.
Содержание белка. На всех стадиях содержание белка определяли по методу Варбурга и Кристиана [15].
Адгезиометрический метод. Для определения мембранотропной активности биорегулятора во фракциях, полученных на каждой стадии очистки, использовали оригинальный адгезиометриче-ский метод, разработанный ранее для идентификации МГТБ [16]. Метод основан на определении вязкоупругих свойств ткани печени в условиях органотипического культивирования печени мышей F1 C57BL/CBA (самцов весом 18-20 г). Статистическую обработку результатов проводили с использованием критерия Стьюдента. Вероятность ошибки цифровых данных находилась в пределах 5%, что отвечает стандартам, принятым для медико-биологическогих исследований.
Высокоэффективная жидкостная хроматография. Супернатант, полученный после осаждения белков, выделенных из тканей мозга крысы Wistar, наносили на колонку Jupiter C5 (4.6 х 150 мм) "Phenomex" (США), уравновешенную водным раствором 0.1%-ной трифторуксусной кислоты, рН 2.2, и подвергали ВЭЖХ в обращенной фазе на хроматографе высокого давления "Kontron" (США).
Связавшийся с сорбентом материал элюировали градиентом концентрации 0—70% ацетонитрила в 0.1%-ной трифторуксусной кислоте, рН 2.2, в течение 70 мин. Скорость элюции — 1 мл/мин. Содержание продуктов определяли спектрофото-метрически при 210 нм.
Триптический гидролиз белка. После ВЭЖХ фракцию, содержащую гомогенный полипептид, гидролизовали трипсином ("Sigma-Aldrich", Германия) в 0.1 М аммоний-бикарбонатном буфере, рН 8.0, в течение 4 ч при 37°С. Соотношение фермент : белок составляло 1 : 50. Реакцию останавливали 0.1%-ной трифторуксусной кислотой, pH 2.2. Полученные пептиды исследовали масс-спектро-метрически.
Масс-спектрометрический анализ. Пептиды анализировали на времяпролетном MALDI-TOF масс-спектрометре UltraFlex 2 ("Bruker Daltonics", Германия), оснащенном азотным лазером 337 нм с частотой импульса до 20 Гц. Все измерения проводили в линейном и рефлекторном режиме, определяя положительные ионы. Для накопления масс-спектров мощность лазерного излучения устанавливали на уровне минимального порогового значения, достаточного для десорбции-ионизации образца. Внешнюю калибровку проводили с использованием точных значений молекулярных масс известных белков. Образец наносили на три ячейки планшета, для каждой из которых записывали спектр, полученный в результате суммирования 10 серий спектров по 50 импульсов лазера для каждой. Для записи, обработки и анализа масс-спектров использовали программное обеспечение фирмы "Bruker Daltonics" (Германия): flex-Control 2.4 (Build 38) и flexAnalysis 2.4 (Build 11). Точность измерения масс составляла ±2 Да. В качестве матрицы использовали насыщенный раствор а-циано-4-гидроксикоричной кислоты ("Sigma-Aldrich", Германия) в смеси 50%-ного ацетонитрила и 2.5%-ной трифторуксусной кислоты. Все использованные реактивы, включая воду, были аналитической или специальной для масс-спектро-метрии чистоты.
Идентификация белков по базам данных. Пептиды идентифицировали с помощью программного пакета Mascot (http://www.matrixscience.com/ search_form_select.html). Поиск проводили по данным масс-спектров в базе данных Swiss-Prot и NCBI (Национальный Центр США по биотехнологической информации) белков всех организмов и, в частности белков, обнаруженных у крыс, с указанием типа гидролиза — трипсин.
Спектры кругового дихроизма. Спектры регистрировали на КД-спектрометре "Jasco 720" (Япония) в УФ-области (185-285 нм) при 20°C в кварцевых кюветах с длиной оптического пути 1 мм. Скорость сканирования 50 нм/мин, шаг 1 нм, накопление каждого шага 2 с. Концентра-
MA
160
140 120 100 80 60 40 20 0
%
(а)
(б)
K 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 K 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17
Рис. 1. Диаграмма дозовой зависимости мембранотропной активности (МА, %) от степени (10-кратного) последовательного разбавления (по оси х) фракции супернатанта, полученного после осаждения белков тканей мозга крысы сульфатом аммония (а) и фракции 1.1, полученной после ВЭЖХ (б). Исходные концентрации супернатанта и фракции 1.1 — 0.1 мг/мл, К — контроль.
ция исследуемого полипептида в водном растворе составляла 220 мкг/мл. Итоговый спектр получали по результатам усреднения данных 3 сканирований и вычитания спектра базовой линии (контроля) [17]. Содержание элементов вторичной структуры оценивали с помощью программ CD Deconvolu-tion и k2d (http://bioinformatik.biochemtech.uni-hal-le.de/cdnn) [18].
Метод динамического лазерного светорассеяния.
Для определения гидродинамического радиуса частиц в водном растворе полипептида использовали метод динамического лазерного светорассеяния. Концентрация полипептида в водном растворе составляла 100 мкг/мл. Измерени
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.