ГЕНЕТИКА, 2008, том 44, № 4, с. 467-473
ГЕНЕТИКА МИКРООРГАНИЗМОВ
УДК 575.116.4
ИССЛЕДОВАНИЕ СВЯЗИ ВТОРИЧНОМ СТРУКТУРЫ И РЕГУЛЯТОРНОЙ АКТИВНОСТИ ЛИДЕРНОГО ТРАНСКРИПТА ОПЕРОНА БИОСИНТЕЗА РИБОФЛАВИНА У Bacillus subtilis
© 2008 г. А. С. Миронов1, Д. В. Карелов2, И. М. Соловьева2, С. Ю. Еремина1, Л. Эрраис Лопес1,
Р. А. Кренева2, Д. А. Перумов2
1 Государственный научно-исследовательский институт генетики и селекции промышленных микроорганизмов, Москва 117545; e-mail: alexmir@genetika.ru 2Отделение молекулярной и радиационной биофизики Петербургского института ядерной физики им. Б.П. Константинова Российской академии наук, Гатчина 3 Ленинградской области 188350;
e-mail: perumov@lbp.ru Поступила в редакцию 18.05.2007 г.
Проведен инсерционный и делеционный мутагенез лидерной области rib-оперона Bacillus subtilis, которая кодирует ФМН-специфическую сенсорную РНК. Показано, что присутствие в консервативной области лидерной последовательности (Rfn-элемент) инсерций различной структуры и протяженности приводит к частично конститутивной экспрессии оперона, что выражается в повышенном накоплении рибофлавина. В то же время внесение в геном инсерционных мутантов дополнительной мутации в гене ribC, блокирующей синтез ФМН, приводит к повышению продукции рибофлавина. К таким же последствиям приводит делетирование основного Rho-независимого терминатора транскрипции. Полученные данные свидетельствуют о наличии дополнительной ФМН-зависимой регуляции rib-оперона, по-прежнему связанной как с первичной, так и с вторичной структурой лидерной области.
У Bacillus subtilis основой флавиногенеза, включающего биосинтез рибофлавина, ФМН и ФАД, является рибофлавиновый оперон, контролирующий всю биохимическую последовательность, начиная со стартового предшественника -гуанозин-5'-трифосфата и кончая рибофлавином [1]. Биосинтез ФМН и ФАД осуществляется ферментами бифункциональной флавокиназы/ФАД-синтазы, кодируемыми геном ribC, и монофункциональной флавокиназы, кодируемой геном ribR, входящими в состав отдельных оперонов [2, 3].
Первоначально было показано, что репрессия рибофлавинового оперона может осуществляться экзогенными флавинами, но механизм репрессии оставался неясным [4]. Однако несколько лет назад был обнаружен новый тип регуляторных лидерных РНК, которые выступают как сенсоры специфических метаболитов - малых молекул (тиамин, ФМН, ФАД) и напрямую, без белковых посредников регулируют транскрипцию или трансляцию соответствующих мРНК [5, 6].
Выяснилось, что у многих бактерий гены биосинтеза рибофлавина имеют в лидерной зоне эво-люционно-консервативный участок (так называемый Rfn-элемент), перекрывающий все сайты точечных мутаций, ведущих к сверхсинтезу рибофлавина у Bacillus subtilis, за которым следует Rho-независимый терминатор транскрипции (рис.1) [7].
На примере рибофлавинового оперона было показано, что вторичная структура лидерной мРНК подвержена конформационным изменениям: в присутствии эффекторов ФМН или ФАД происходит формирование терминатора транскрипции, а в их отсутствие - антитерминатора, обеспечивающего сквозную транскрипцию структурной части оперона [5]. Взаимодействие флавинов с ИШ-элементом уже детально изучено [8], и нет сомнения, что именно этот процесс играет основную роль в регуляции рибофлавинового оперона. Тем не менее в процессе нашей работы накопились данные, свидетельствующие о существовании регулирующих оперон дополнительных элементов, изучение которых и составляет предмет настоящей работы.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
В работе использованы следующие штаммы Bacillus subtilis из коллекции ОМРБ ПИЯФ РАН: RKH25 (hisA); RK25-C1 (hisA ribC1); RK99-C1(lysA9 ribC1); RK42 (lysA42); RK110(ribB110) и RK102 ((hisA ribO86).
Условия культивации клеток, состав питательных сред на основе среды Спицайзена, определение концентрации рибофлавина были описаны ранее [9].
467
3*
-35 -10
agtttatttcaTTGCGTactttaaaaaggatcgcTATAATaaccaat
<<<<<<<T<<<<<<AAA<<<<<<<T<<<<<<A<<AAA< +1 AAGGACAAATGAATAAAGATTGTATCCTTCGGGGCAGGGTGGAAATCCCGACCGGCGGTA +60
GTAAAGCACATTTGCTttagagcccgtgacccgtgtgcataagcacgcggtggattcagt +12 0 ------->IRi<------Banll -------> IR2 <-------
ttaagctgaagccgacagtgaaagtctggatgggacaaggatgatgagccgctatgcaaa +180
------------->
atgtttAAAAATGCATAGTGTTATTTCCTATTGCGTAAAATACCTAAAGCCCCGAATTTT +24 0
Term <------------------------M E -ribG—>
TTATAAATTCGGGGCTTTTTTGACGGTAAATAACAAAAGAGGGGAGGGAAACAAATGGAA
Рис. 1. Нуклеотидная последовательность регуляторной зоны рибофлавинового оперона B. subtilis. Заглавными буквами на последовательности отмечены: блоки -10 и -35; инвертированные повторы, фланкирующие сайт рестрикции gagccc BаnII; шпилька р-независимого терминатора транскрипции. Жирным шрифтом показаны: (ТТСООООС) - последовательность антитерминатора и (ОССССОАА) - комплементарный ему участок терминатора; заглавными буквами над основной последовательностью обозначены сайты возникновения точечных мутаций, приводящие к конститутивной экспрессии оперона; значками «» отмечены границы Я^-элемента. Строчными буквами показаны границы делеции в 110 нуклеотидов. Стрелками <===> показан потенциальный дополнительный терминатор транскрипции. АТО - стартовый кодон первого структурного гена оперона. А - точка отсчета координат праймеров. Делетированная часть терминатора подчеркнута.
Получение штамма RK200 (hisA rib AT1), у которого из регуляторной зоны делетирован основной терминатор транскрипции, было проведено следующим образом. Сначала проводили ПЦР-ам-плификацию двух фрагментов с использованием хромосомной ДНК и пар праймеров R1 gctctagacagc-cgtaacggccttg (с координатми -777 относительно старта транскрипции), R3 tttgttatttaccggggctttaggtattt-tacgc (+230) и R4 aatacctaaagccccggtaaataacaaaagaggg (+254), R2 ggggtacccgaaccggctgttttgt (+1045) [10]. Полученные фрагменты R1-R3 и R4-R2 отжигались друг на друга с формированием делеции AT1 (31 пн), а затем амплифицировались с помощью фланкирующих праймеров R1 и R2. Полученный фрагмент длиной 1689 пн, содержащий делецию AT1, обрабатывали рестриктазами XbaI и KpnI и клонировали в вектор pBSKS. Полученная плазми-да pBSKS-1 была использована для прямой трансформации штамма RKH25 к устойчивости к розе-офлавину в концентрации 0.5 мг/мл, служащей селективным признаком конститутивного синтеза рибофлавина [11]. Отобранные трансформанты служили донором в трансформационном скрещивании, где реципиентом служил штамм RK42. Среди трансформантов к прототрофии по лизину были отобраны накапливающие рибофлавин клоны, секвенирование которых показало наличие делеции. Других изменений в регуляторной зоне оперона обнаружено не было. На последней стадии селекции делеция AT1 была снова перенесена в штамм RKH25, и полученный таким образом штамм обозначен RK200 (hisA rib AT 1). Про-
изводный от RK200 штамм RK200-C1 (hisA rib AT 1 ribCl) был получен при трансформации штамма RK99-C 1(lysA9 ribCl) с помощью ДНК штамма RK200 к прототрофии по лизину и отбору кон-грессантов hisA. Таким же способом был получен двойной мутант, содержащий точковую мутацию в консервативной области лидера ribO86 и делецию AT1, но с использованием в качестве матрицы в ПЦР-реакциях хромосомной ДНК, выделенной из мутантного штамма B.subtilis ribO86.
Фрагменты ДНК, содержащие rib AT 1, ribO86 и двойную мутацию ribAT1 ribO86, были клонированы также в составе интегративного экспресси-онного вектора pDG268 для получения транскрипционных фьюзов лидерной области rib-опе-рона с репортерным геном lacZ и их последующей интеграции в ген amyE на хромосоме B. subtilis, как описано в работе [4] .
Получение инсерционных мутантов в регуляторной зоне рибофлавинового оперона с использованием плазмиды pLP102 было описано нами ранее [12]. В данной работе мы использовали двуцепочеч-ные вставки следующих олигонуклеотидов (приведены только 5'-3'-последовательности, выделена последовательность для сайта рестрикции Banll): 1) 5'-taaagcacaagcc-3'; 2) 5'-taaagcacatttgctttaagcc-3'; 3) 5'-tttgctttaagcc-3'; 4) 5'-acacgaaatagcc-3'; 5) 5'-ttgctttataaag-cacaagcc-3'; 6) 5'- atttcgtttacacgaaatagcc-3'; 7) 5'-atttcgtt-tagcc-3'; 8) 5'-attgcgtactttaaaaaggatcgctataataaccagcc-3'; 9) 5'-aaagccccgaattttttataaattcggggcttt-3'; 10) 5'- tttcgggg-cttaaattttttaagccccgaaaagcc-3'. Данные олигонуклео-тиды представляют собой различные варианты
инвертированного повтора IR1 (№ 1-7), основного промотора оперона (< 8), а также прямой (№ 9) и обратной (№ 10) последовательностей терминатора (рис. 1). В каждом случае плазмида pLP102 была подвергнута действию эндонуклеазы BanII, после чего к рестрикционной смеси добавлялись отожженные олигонуклеотиды и проводилось лигирование. Лигазная смесь использовалась для трансформации клеток рибофлавинового ауксо-трофа B. subtilis RK110 с отбором прототрофных по рибофлавину клонов. Среди трансформантов по наличию флуоресценции в УФ-свете отбирались мутанты, накапливающие рибофлавин. Присутствие инсерций в геноме трансформантов подтверждалось секвенированием. Конститутивные мутанты были обнаружены во всех вариантах, за исключением вставок №4 и 9. Таким образом, было получено семейство инсерционных мутантов B. subtilis RK211-ins (ribOins). Варианты, содержащие мутацию ribCl B. subtilis 211-С1 (ribCI ribOins), были получены методом конгрессии маркеров [9].
Трансформирующую ДНК выделяли по методу Саито и Миуры [13], плазмидную ДНК - согласно [14], трансформационные эксперименты проводили по Анагнастопулосу и Спицайзену [15].
Активность Р-галактозидазы определяли по Миллеру [16]. Бактериальную культуру выращивали при 37°С в жидкой среде Спицайзена с необходимыми добавками и глюкозой (0.4%) в качестве источника углерода до поздней log-фазы роста.
Манипуляции с ДНК (выделение плазмидной ДНК, клонирование, трансформацию и анализ рекомбинантных плазмид) проводили с использованием стандартных методов, изложенных в [14]. Препараты ферментов: эндонуклеазы рестрикции, Т4 ДНК-лигаза, термостабильная Taq-поли-мераза - фирмы "MBI Fermentas".
Последовательность нуклеотидов у всех полученных конструкций проверяли секвенированием по методу Сэнгера [17].
Эксперименты по Norther
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.