УДК 577.151.63
ИССЛЕДОВАНИЕ ЦИТОБИОХИМИЧЕСКИМ МЕТОДОМ СИГНАЛЬНОГО ДЕЙСТВИЯ ЯНТАРНОЙ КИСЛОТЫ НА МИТОХОНДРИИ
© 2012 г. Н. В. Хундерякова1, М. В. Захарченко1, А. В. Захарченко1, А. В. Сусликов2, А. В. Волков3, Т. Ю. Телешева3, М. Н. Кондрашова1*
Институт теоретической и экспериментальной биофизики РАН, 142290, Московская обл., Пущино, ул. Институтская, 3;
*электронная почта: mkondrashova23@inbox.ru 2Больница Пущинского научного центра РАН, 142290, Московская обл., Пущино, ул. Институтская, 1 3Клиника доктора Волкова, ООО "Эколабмедтест", Москва, Комсомольский просп., 28
Поступила в редакцию 01.07.2011 г.
После доработки 19.04.2012 г.
Проведено сравнительное исследование активности сукцинатдегидрогеназы при добавлении янтарной кислоты в обычно используемых, сильно завышенных по сравнению с содержанием в тканях, миллимолярных, "субстратных" концентрациях (5 мМ), и реально существующих в организме микромолярных концентрациях (5—50 мкМ), называемых в настоящее время "сигнальными". Это название отражает вторую функцию субстрата окисления янтарной кислоты как сигнального вещества — регулятора физиологических процессов. Регуляторное, сигнальное действие янтарной кислоты проявляется в значительно более низких концентрациях, чем субстратное (не менее чем в 1000 раз). Сигнальное действие янтарной кислоты связано с адренергической регуляцией, включающей сукцинат-дегидрогеназу как ее мишень. Оно реализуется через специфический рецептор янтарной кислоты ОРЯ91. В данной работе определяли активность сукцинатдегидрогеназы крыс и человека новым ци-тобиохимическим методом, который выявляет изменения в организме благодаря сохранению натив-ного состояния митохондриальной сети. Активность сукцинатдегидрогеназы может быть измерена в лимфоцитах на мазке крови по восстановлению нитросинего тетразолия за счет окисления добавленных и эндогенных субстратов. Дополнительным достоинством метода является высокая статистическая значимость, так как каждая отдельная величина измеряется видеомикроскопическим сканированием множества (200—700) окрашенных объектов (митохондрий) в одном образце, содержащем изображения 30 лимфоцитов индивидуума. Высокая чувствительность цитобиохимического метода позволила измерить активность сукцинатдегидрогеназы в присутствии янтарной кислоты не только в миллимолярных, но и в микромолярных концентрациях. Выявлена активация сукцинатдегидрогеназы при усилении адренергической регуляции в норме (введением адреналина) и в острой фазе гипертонии с переходом к ингибированию при стабилизации артериального давления гипотензивными препаратами — блокаторами адренорецепторов и внутренними регуляторами при хроническом течении. Использование янтарной кислоты в микромолярных концентрациях позволяет с большей чувствительностью выявить изменения активности сукцинатдегидрогеназы, соответствующие различиям в физиологическом состоянии организма, чем при использовании субстратных концентраций, которые активируют фермент и маскируют развитие ингибирования при углублении патологии. При сниженной активности сукцинатдегидрогеназы, измеренной в присутствии янтарной кислоты в мил-лимолярной концентрации, наблюдается значительное повышение восстановления нитросинего тет-разолия в присутствии микромолярных концентраций янтарной кислоты. Это явление указывает на то, что действие сигнальных концентраций, в отличие от субстратных, может реализоваться через образование в митохондриях супероксида и перекиси водорода, которые в микромолярных концентрациях обладают жизненно необходимыми благоприятными регуляторными эффектами.
Ключевые слова: сукцинатдегидрогеназа, рецептор янтарной кислоты, янтарная кислота, адреналин, лимфоциты.
Сигнальное (т.е. регуляторное действие в низких концентрациях) янтарной кислоты (ЯНТ), самого мощного субстрата окисления в митохондриях, можно назвать феноменом XXI века. Широкий интерес к нему возник после открытия в
2004 г. специфического рецептора ЯНТ — ОРЯ91 — сначала в почках, а вскоре и в других органах [1—6]. В начале предыдущего столетия Бателли и Штерн впервые обнаружили, что скорости окисления ЯНТ выше скорости окисления других субстра-
тов. Позже это свойство было исследовано Чан-сом, который показал, что скорость окисления ЯНТ может быть превышена в 2—3 раза (а в начальных работах на 1—2 порядка). Такое преимущество в скорости окисления может приводить к доминированию ЯНТ в дыхании, названном Кребсом "монополизацией дыхательной цепи". Явление высокой "восстановительной мощности" окисления ЯНТ, выражающееся в доминирующем энергозависимом восстановлении NAD+, необходимом для энергообеспечения и биосинтезов, заставляло думать об особых регуляторных функциях этого субстрата окисления. Это предположение исследовалось на протяжении нескольких десятилетий, и, в частности, было показано, что введенная в организм ЯНТ (в расчете на вес тела) действует в значительно более низких микромолярных концентрациях, чем необходимо для обеспечения митохондрий субстратом [7, 8]. Интересно, что эти же концентрации соответствуют содержанию ЯНТ в крови и тканях организма [9, 10].
В одном из первых опытов старым самкам крыс вводили в течение пяти дней ЯНТ в микромолярных концентрациях внутрибрюшинно и непосредственно в желудочек гипоталамуса. В обоих случаях ЯНТ восстанавливала потерянную реактивность гипоталамуса старых животных до более высокого уровня, чем у молодых [11]. Полученные результаты впервые четко показали высокую физиологическую активность низких доз ЯНТ и поставили вопрос о механизме ее действия. Это действие было названо в нашей группе сигнальным задолго до появления этого термина в связи с открытием рецепторов.
Одним из механизмов сигнального действия ЯНТ является обнаруженная в 1982 г. активация выделения адреналина/норадреналина. Прием янтарнокислого аммония (в микромолярных концентрациях) стимулировал диурез и выброс катехоламинов у спортсменов [12—14]. Таким образом, сигнальные концентрации ЯНТ стимулируют выделение катехоламинов, которые включают каскад процессов, поддерживающих физиологические функции. Регуляторная взаимосвязь ЯНТ и катехоламинов была показана в работах по их взаимно усиливающему влиянию на окисление этого субстрата, чувствительному к блокато-рам адренорецепторов [15]. Эти работы привели к созданию представления о существовании физиологической системы регуляции, связывающей активность симпатической нервной системы и окисление в митохондриях, названной субстратно-гормональной. Ее второй частью является связь парасимпатической нервной регуляции и окисления а-кетоглутаровой кислоты [7, 8, 15— 18]. Таким образом, в механизме сигнального действия ЯНТ важную роль играет связь с нервной адренергической регуляцией. Важно, что этот механизм сигнального действия ЯНТ под-
тверждается более поздними исследованиями, согласно которым ЯНТ, по-видимому, активирует ренин-ангиотензиновую систему через обнаруженный в почках рецептор ЯНТ — ОРЯ91. Далее ангиотензин II повышает активность тирозин-гидроксилазы — фермента, участвующего в биосинтезе адреналина [19, 20]. Впервые рецептор ЯНТ был обнаружен именно в почках, где его функция сильнее проявляется. Возможно, это связано с тем, что фермент, окисляющий ЯНТ, в почке значительно более активен, чем другие де-гидрогеназы цикла Кребса. К особой роли сукци-натдегидрогеназы (СДГ) как фермента, уровень которого высок в органах с интенсивным транспортом ионов, требующих мощного энергообеспечения, настойчиво привлекали внимание Гине-цинский и Наточин [21, 22]. Эти данные, так же как участие СДГ в адренергической регуляции, послужили предпосылкой нашего исследования активности СДГ в присутствии ЯНТ в микромолярной концентрации. Кроме известных регуляторных эффектов катехоламинов, таких как активация распада углеводов и липидов, существуют и другие, очень важные, которым не уделяется должного внимания. Показана активация адреналином притока ЯНТ через трансаминирование [15], а также избирательная активация адреналином окисления ЯНТ [7, 13—16, 23]. Аналогичное влияние адреналина показано и на изменение активности СДГ [24—28]. Эти данные согласуются с представлением о существовании субстратно-гормональной системы ЯНТ—адреналин. На основании этих представлений активность СДГ, окисляющей ЯНТ, может рассматриваться как информативный показатель адренергической регуляции.
Снижение активности СДГ приводит к ослаблению функций митохондрий и контроля ими гликолиза, что при значительном прогрессирова-нии создает предпосылки для опухолевого роста [14, 29]. Напротив, нормально работающая СДГ рассматривается как "опухолевый супрессор" [30] и активатор Пастеровского эффекта [7].
Влияние введения микромолярных (сигнальных) концентраций ЯНТ животным на дыхание митохондрий невозможно оценить, используя стандартный полярографический метод, поскольку окисление ЯНТ в микромолярных концентрациях показывает очень низкие величины дыхания. Поэтому измерение окисления ЯНТ проводят при ее заведомо более высокой концентрации, чем в организме. Вследствие этого вопрос о возможности влияния на дыхание именно низких сигнальных концентраций остается открытым. Измерение в присутствии ЯНТ в субстратных, нефизиологических, высоких миллимоляр-ных концентрациях может приводить к завышению измеряемой величины самим субстратом, который является двойным аллостери-
ческим активатором СДГ [31]. Кроме того, активация дыхания добавками ADP, Са2+ или разобщителями с целью повышения чувствительности измерения нарушает исходное состояние покоя митохондрий и снижает чувствительность измерения к стимуляции в организме или даже исключает эту возможность.
Мы предприняли попытку оценить влияние ЯНТ в микромолярных концентрациях на окисление в митохондриях в условиях разработанного цитобиохимического (ЦБХ) метода при сохранении нативной организации митохондриалной сети в лимфоцитах, иммобилизованных на стекле, в мазке крови [32, 33]. Это обеспечивает сохранение состояния покоя и значительно более высокую чувствительность наблюдаемых реакций митохондрий к физиологической активации дыхания в организме.
МАТЕРИАЛЫ И М
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.