ГЕНЕТИКА ЧЕЛОВЕКА
УДК 575.224.29:616-006.66
ИССЛЕДОВАНИЕ ВЛИЯНИЯ ОДНОНУКЛЕОТИДНЫХ ЗАМЕН В ГЕНАХ MnSOD, GPX1 И GSTP1 НА РИСК РАЗВИТИЯ СЕМЕЙНОГО И СПОРАДИЧЕСКОГО РАКА МОЛОЧНОЙ ЖЕЛЕЗЫ У ЖИТЕЛЬНИЦ АЛТАЙСКОГО КРАЯ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ
© 2010 г. Н. А. Ермоленко1, У. А. Боярских1, А. Г. Сушко1, Е. Н. Воронина1, И. А. Селезнева2, Т. В. Синкина2, А. Ф. Лазарев2, В. Д. Петрова2, М. Л. Филипенко1
Учреждение Сибирского отделения Российской академии наук Институт химической биологии и фундаментальной медицины, Новосибирск 630090;
e-mail: niboch@niboch.nsc.ru, Kostrykina@gmail.com 2Алтайский филиал Российского онкологического научного центра им. Н.Н. Блохина Российской академии медицинских наук, Алтайский край, г. Барнаул 656049 Поступила в редакцию 01.12.2009 г.
Исследована распространенность полиморфных вариантов генов MnSOD Ala^al, GPX1 Pro^Leu и GSTP1 Ilei05Val среди жительниц Алтайского края, больных раком молочной железы. Показано, что частоты встречаемости генотипов всех рассматриваемых генов в исследуемой и контрольной группах соответствовали равновесию Харди—Вайнберга. Полученные нами частоты встречаемости генотипов исследуемых генов в контрольной группе не отличались от таковых, опубликованных ранее для представительниц европеоидной расы, проживающих в Европе. Было показано, что носи-тельство аллеля Т (rs1050450) гена GPX1 является протективным в отношении спорадического рака молочной железы (OR = 0.74 (95% CI = 0.58—0.94), p = 0.012). Совместное носительство генотипов MnSOD CC + GPX1 CC увеличивает риск развития спорадического рака молочной железы в 1.6 раза (OR = 1.59 (1.05—2.41), p = 0.0258). Нами не было обнаружено значимых ассоциаций полиморфных локусов GSTP1 (rs1695) и MnSOD (rs4880) с увеличением риска развития семейного или спорадического рака молочной железы.
В России рак молочной железы является самой распространенной причиной смертности от онкологических заболеваний у женщин в возрасте 40—69 лет. В 2005 г. на долю рака молочной железы приходилось 19.8% всех случаев злокачественных новообразований, выявленных среди женского населения [1]. К факторам риска рака молочной железы относят семейный анамнез, раннее менархе и позднюю менопаузу, отсутствие беременностей и родов, позднее рождение первого ребенка, отсутствие грудного вскармливания, облучение молочных желез, употребление алкоголя, ожирение, низкий уровень физической активности, длительный прием оральных контрацептивов или препаратов заместительной гормональной терапии [2]. Однако данные факторы могут объяснить только одну треть случаев заболевания. Предполагается, что развитие рака является результатом взаимодействия генетических факторов, факторов окружающей среды и образа жизни.
Нарушения в работе ферментов, участвующих в обмене реактивных производных кислорода, могут потенциально увеличивать риск возникновения злокачественных клеток. Несмотря на присутствие антиоксидантной защитной системы в
клетках, повреждения ДНК, белков и липидов, обусловленные свободными радикалами, накапливаются в течение жизненного цикла клетки. Предполагается, что такие повреждения могут играть ключевую роль в развитии онкологических заболеваний, атеросклероза и нейродегене-ративных заболеваний [3, 4].
В организме человека реактивные производные кислорода образуются под воздействием внешнего рентгеновского, гамма- и УФ-излуче-ния; являются продуктами метаболических реакций, катализируемых переходными металлами; продуцируются нейтрофилами и макрофагами в очаге воспаления; являются побочными продуктами реакций цепи переноса электронов в митохондриях.
Воздействие реактивных производных кислорода сбалансировано действием антиоксидантов, к которым относят витамины С и Е, каротинои-ды, тиоловые антиоксиданты (глутатион, тире-доксин, липоевую кислоту), природные флавоно-иды, гормоны эпифиза [4]. Кроме того, ферменты супероксиддисмутаза (SOD) и каталаза (САТ) нейтрализуют супероксид анион и пероксид водорода соответственно; конъюгация с восстановленным глутатионом под действием глутатион
1685
Реактивные производные кислорода образуются NAD(P)H оксигеназным комплексом и в цепи переноса электронов. Супероксиддисмутазы (SOD) превращают супероксид-радикал в пероксид водорода, глутатион пероксидазы (GPX) и каталаза (CAT) восстанавливают пероксид водорода до кислорода и воды. Глутатион используется для детоксикации ксенобиотиков при участии глутатион^-трансфераз (GST) [2]. GSH — восстановленный глутатион, GSSG — окисленный глутатион, GSR — глутатион^-редуктаза.
пероксидаз (GPX) и глутатион^-трансфераз (GST) защищает клетки от свободных радикалов, пероксидов и большого числа ксенобиотиков (рисунок) [5, 6].
Полиморфные варианты генов, влияющие на активность антиоксидантных ферментов, могут изменять риск развития заболеваний, ассоциированных с воздействием реактивных производных кислорода, образующихся при употреблении алкоголя, курении, воздействии ионизирующей радиации или приеме гормональных препаратов [7]. Ранее была показана ассоциация полиморфных вариантов генов MPO, GPX, CAT, MnSOD с риском развития лимфом [8, 9], рака молочной железы [10, 11], рака предстательной железы [12] и рака легких [13—16].
В данной работе мы выполнили исследование с участием 1440 женщин, жительниц Алтайского края, для выяснения влияния однонуклеотидных замен в генах MnSOD (rs4880), GPX1 (rs1050450) и GSTP1 (rs1695) на риск развития семейного и спорадического рака молочной железы.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
Исследуемая группа состояла из 672 женщин, больных спорадическим раком молочной железы (возраст 50—79 лет, средний 53 ± 9 лет), 288 женщин, больных семейным раком молочной железы (возраст 20—74, средний 47 ± 11 лет); контрольная группа состояла из 480 женщин (возраст 19—84 года, средний 54 ± 13 лет) без онкологических заболеваний в анамнезе. Женщины для исследования были отобраны среди пациенток Алтайского филиала Российского онкологического научного центра им. Н.Н. Блохина РАМН и Алтайского краевого онкологического диспансера.
Для женщин исследуемой группы указывались следующие данные: возраст, менопаузальный статус, диагноз, дата установления диагноза рака молочной железы (клинического и патоморфоло-гического), семейный анамнез рака молочной
железы, отношение к курению, рост и вес. Главным критерием включения в исследуемую группу был верифицированный гистологически диагноз рака молочной железы.
Диагноз "семейный рак молочной железы" ставился, если имелись указания на наследственный характер заболевания (два случая рака молочной железы до 50 лет в одной семье, три и более случаев рака молочной железы, семейная ассоциация рака молочной железы и других онкологических заболеваний) или тяжелое течение заболевания (начало заболевания до 40 лет, билатеральный рак, сочетание рака молочной железы и рака яичника или другой онкологической патологии). Женщины, больные раком молочной железы, не отвечающие критериям, перечисленным выше, были отнесены к группе спорадического рака молочной железы.
Все обследуемые женщины заполняли информированное согласие на участие в исследовании в соответствии с требованиями этического комитета.
От женщин были получены образцы венозной крови. ДНК выделялась из мононуклеаров стандартным методом с помощью экстракции фенол-хлороформом [17].
Генотипирование проводилось методом ПЦР в режиме реального времени с использованием конкурирующих ТадМап-зондов, комплементарных полиморфному участку ДНК.
Каждый образец амплифицировали с использованием пары праймеров и двух зондов, несущих "гаситель" на З'-конце и разные флуоресцентные красители ^АМ либо R6G) на 5'-конце. Структуры праймеров и зондов для типирования ОРХ и ОБТР1 приведены в табл. 1, для ШпБОБ опубликованы ранее [18]. Общий объем реакционной смеси составлял 25 мкл, смесь содержала 40—100 нг ДНК; 300 нМ каждого праймера; по 100—200 нМ Тад-Мап-зондов, конъюгированных с FAM или R6G; 200-мкМ dNTP, амплификационный буфер, термостабильную Тад-полимеразу — 0.5 ед.акт./реакц.
Таблица 1. Структуры праймеров и зондов, используемых для типирования GPX1 (rs!050450) и GSTP1 (rs!695)
Локус Праймеры Зонды
GPX1 GSTP1 5'-GCTTCCAGACCATTGACATC -3' 5'-CGAGGTGGTATTTTCTGTAAGATC-3' 5'-GATGCTCACATAGTTGGTGTAG-3' 5 ' - GGTGGACATGGTGAATGAC - 3 ' 5'-R6G-CTCAAGGGCTCAGCTGTGC-BHQ-3' 5'-FAM-CTCAAGGGCCCAGCTGTGC-BHQ-3' 5'-FAM-CTGCAAATACATCTCCCTCAT-BHQ-3' 5'-R6G-CGCAAATACGTCTCCCTCAT-BHQ-3'
Примечание. В структурах зондов полужирным шрифтом выделены отличающиеся нуклеотиды, соответствующие
ПЦР проводили в следующих условиях: начальная денатурация 3 мин при 96°С; затем 40 циклов, включающих денатурацию при 96°С 8 с, отжиг праймеров и последующую элонгацию при 60°С 35 с (каждый шаг сопровождался регистрацией флуоресцентного сигнала в диапазонах, соответствующих интервалам флуоресценции флуоро-форов FAM и R6G).
Сравнение частот встречаемости аллелей и генотипов полиморфного локуса в исследуемых группах методом х2 проводили с использованием программного пакета Statistica (StatSoft Inc., США). Соответствие выборок равновесию Хар-ди—Вайнберга определяли с помощью доступного в он-лайн-режиме программного обеспечения на сайте Института генетики человека (Мюнхен, Германия, http://ihg2.helmholtz-muenchen.de/cgi-bin/hw/hwa l.pl).
РЕЗУЛЬТАТЫ
На первом этапе исследования нами был разработан метод генотипирования однонуклеотид-ных замен в генах GPX1 и GSTP1 с помощью ПЦР в режиме реального времени с использованием конкурирующих TaqMan-зондов. Зонды отличаются по структуре на один нуклеотид, соответствующий SNP (находится в центре олигонуклеотидно-го зонда). При оптимизации условий амплификации варьировали соотношение концентраций зондов, температуру отжига праймеров, состав амплификационного буфера. Достоверность ге-нотипирования подтверждалась секвенировани-ем. При оптимизации были подобраны условия, которые использовались для типирования (приведены в разделе "Материалы и методы").
После генотипирования полиморфных локу-сов MnSOD Ala9Val (rs4880), GPX1 Pro198Leu (rs1050450) и GSTP1 Ile105Val (rs1695) было определено соответствие распределения генотипов з
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.