научная статья по теме ИССЛЕДОВАНИЕ ВНУТРИМОЛЕКУЛЯРНОГО И МЕЖМОЛЕКУЛЯРНОГО ПЕРЕНОСА ЭЛЕКТРОНОВ ЭЛЕКТРОХИМИЧЕСКИМИ МЕТОДАМИ Биология

Текст научной статьи на тему «ИССЛЕДОВАНИЕ ВНУТРИМОЛЕКУЛЯРНОГО И МЕЖМОЛЕКУЛЯРНОГО ПЕРЕНОСА ЭЛЕКТРОНОВ ЭЛЕКТРОХИМИЧЕСКИМИ МЕТОДАМИ»

БИОФИЗИКА, 2013, том 58, вып. 3, с. 453-460

МОЛЕКУЛЯР НАЯ БИОФИЗИКА =

УДК 612.017.2

И ССЛЕДОВАНИЕ ВНУТРИМОЛЕКУЛЯРНОГО И МЕЖМОЛЕКУЛЯРНОГО ПЕРЕНОСА ЭЛЕКТРОНОВ ЭЛЕКТР ОХИМИЧЕСКИМИ МЕТОДАМИ

© 2013 г. В.В. Шумянцева, Т.В. Булко, В.Б. Лисицына*, В.Б. Урлахер**, А.В. Кузиков, Е.В. Супрун, А.И. Арчаков

Научно-исследовательский институт биомедицинской химии имени В.Н. Ореховича (ФГБУ «ИБМХ» РАМН),

119121, Москва, ул. Погодинская, 10;

*Российский национальный исследовательский медицинский университет им. Н .И. Пирогова (ГБОУ ВПО РНИМУ им. Н.И.ПироговаМинздравсоцразвития России), 117997, Москва, ул. Островитянова, 1;

**Дюссельдорфский Университет им. Г. Гейне, Дюссельдорф, Германия E-mail: viktoria.$НитуаМ$еуа@1Ьтс.т$к.ru Поступила в p едакцию 16.05.12 г.

После доработки 13.11.12 г.

И сследован внутримолекулярный и межмолекулярный перенос электронов электрохимическими методами во флавогемопротеине цитохроме P450 ВМ 3 и между цитохр омом Ь5 и цитохромом с соответственно. Флавогемопротеин был иммобилизован на графитовом печатном электроде, модифицированном биосовместимым нанокомпозитным материалом на основе синтетического мембраноподобного вещества дидодецилдиметиламмоний бромида (DDAB) и наночастиц золота. Аналитические характеристики DDAB/Au/P450 ВМ 3 электродов были исследованы методами цикловольтамперометрии и квадратно-волновой вольтамперометрии. Показано, что происходит внутримолекулярный перенос электронов между отдельными доменами в молекуле флавогемопротеина. Электрон-транспортная цепь в редокс-цикле цитохр ома P450 ВМ 3 при иммобилизации фермента на поверхность электрода реализуется следующим образом: электрод ^ флавиновые нуклеотиды ^ гем. Перенос электронов происходит внутримолекулярно и свидетельствует о функциональном взаимодействии флавинового и гемового доменов. П ро-веден анализ электрохимического поведения фермента в присутствии природного субстрата (лауриновой кислоты) и ингибиторов метирапона и имидазола. Межмолекулярный перенос электронов исследован в системе двух гемопротеинов цитохром Ь5-цитохром с. Электрохимический анализ показал возможность регистрации переноса электронов в белок-белковых комплексах между белками с различными окислительно-восстановительными потенциалами.

Ключевые слова: цитохром Р450 BM3, цитохром Ь5, цитохром с, электрохимия, электрокатализ, перенос электронов.

Перено с электронов в биохимических системах контролир ует множество пр оцессов: при регуляции фотосинтеза, при дыхании, в ферментативных реакциях, при контроле уровня экспрессии генов, конформационных изменениях в белок-белковых комплексах, р егуляции сигнальных путей.

Цитохром Р450 ВМ 3 относится к классу мо-нооксигеназ жирных кислот и состоит из диф-лавинового редуктазного домена (РЛБ/РМК) и гемового домена на одной полипептидной цепи [1]. Нахождение двух электроактивных групп на одной полипептидной цепи делает перенос

Сокращения: DDAB - дидодецилдиметиламмоний бромид, ЦВА - цикловольтамперограмма, КВВА - квадратно-волновая вольтамперометрия.

электронов высокоэффективным и характеризуется высокими скоростями переноса электро -нов (кса1 = 25 с-1 для реакции гидроксилиро-вания лауриновой кислоты [2]). Ранее нами были исследованы электрохимические свойства цитохромов Р450 2В4, 1Л2, 3Л4, 11Л1 (Р4508сс), Р450 51Ь1 (СУР51), СУР17Л1 [3]. В электрохимических системах электрод служит донором электронов, и электроны поступают в активный центр (центры) фермента с электрода, без участия природного донора электронов КЛБРЫ. Модификация графитовых электродов мембра-ноподобным поверхностно-активным веществом бромидом дидодецилдиметиламмония (ВБЛВ) и наночастицами золота позволяет исследовать прямой безмедиаторный перенос электронов. Исследованные ранее цитохромы

Р450 содержат один электроактивный центр -гем - и характер изуются соответственно одним центром регистрации электроактивности белка. Флавогемопротеин цитохром Р450 ВМ3 имеет два электроактивных центра - флавины и гем, имеющие различные окислительно-восстановительные потенциалы. Целью данной работы является исследование внутримолекулярной электрон-транспортной цепи при электрохимическом восстановлении флавогемопротеина ци-тохр ома Р450 ВМ 3, а также изучение фер мент-субстратных и фермент-ингибиторных взаимодействий электрохимическими методами.

Моделирование живой клетки невозможно без всей совокупности данных динамической протеомики, которая изучает изменения концентраций и локализации белков и их взаимодействия друг с другом. Нарушение белок-белковых взаимодействий может приводить к возникновению различных заболеваний, включая опухолевые, нейродегенеративные, сердечнососудистые, аутоиммунные. Поэтому изучение взаимодействующих пар тнеров и анализ белковых сетей, образованных белок-белковыми взаимодействиями, пр едставляет собой важный инструмент в диагностике заболеваний, выяснении механизма их возникновения и развития, а также эффективности тех или иных терапевтических подходов [4].

Белок-белковые взаимодействия обуславливают образование стабильных белковых комплексов, имеющих важное функциональное значение. Одна из важных функций при образовании белок-белковых комплексов - перенос электронов. Наиболее эффективным подходом для изучения перено са электронов в различных системах являются электрохимические методы, позволяющие проводить прямую регистрацию процессов электронного транспорта для исследования функциональной активности систем. В связи с этим в данной работе ставилась задача: исследовать межмолекулярный перенос электронов между белками электрохимическими методами на примере белок-белкового комплекса цитохром ¿5—цитохром с, а также обосновать возможность применения метода для анализа сложных физиологически значимых белок-белковых взаимодействий.

Межмолекулярный перенос электронов был исследован в комплексе гемопротеинов цитохром ¿5-цитохр ом с. Показано, что митохонд-риальный цитохром Ь5 является донор ом электронов по отношению к цитохрому с, это про -является в «несимметр ичности» окислительных и восстановительных пиков цитохр ома с и появлению каталитического окислительного пика цитохрома с. Перенос электронов не зарегист-

рирован в комплексе цитохр ом ¿5 (как микро -сомальный, так и митохондриальный) - цитохром P450 3А4, по-видимому, вследствие небольшой разности потенциалов этих гемопро-теинов: восстановительный потенциал Ered (митохондриальный цитохром ¿5) = - 0,369 ± 0,005 В, Ered (микросомальный цитохром b5) = -0,345 ± 0,005 В и Ered (цитохром P450 ЗА4) = -0,403 ± 0,005 В (относительно хлорсеребряного электрода сравнения Ag/AgCl).

Разработанные в данном исследовании подходы могут быть применены для изучения цитохр ом Р450-содержащих систем как наиболее важных в метаболизме лекарственных препаратов и других экзогенных соединений [5]. Обра -зование комплексов между различными изофор-мами цитохромов Р450 может пр иводить к изменению субстратной специфичности, стерео -специфичности, степени сопряжения (т.е. эффективности использования кислорода в моно-оксигеназных р еакциях). К р оме того, на обра -зование белок-белковых комплексов с белками редокс-партнерами в цитохр ом Р450-содержа-щих системах может влиять полиморфизм ци-тохромов Р450. Так как перенос электронов является основной реакцией в этих комплексах, электрохимические методы могут быть применены для исследования образования продуктивных комплексов с реализацией каталитической функции [6].

МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

В работе использованы: бромид дидодецил-диметиламмония, боргидрид натрия и золото-хлористоводородная кислота, полученные от фирм Sigma и АМисИ (США); пр епа рат реком-бинантного цитохр ома Р450 ВМ 3 (4,59 мг/мл) был любезно предоставлен зав. лабораторией ФГБУ «ИБМХ» РАМН к.б.н. В.Г. Згодой [7]. Концентрацию фермента определяли спектро-фотометрически по образованию комплекса восстановленной формы с оксидом углерода, используя коэффициент поглощения £450 = 91 мМ-1см-1. Синтез коллоидного раствора золота (наночастиц золота), стабилизированного DDAB, проводили согласно [8]. Полноразмерный цитохр ом Ь5 внешней мембраны митохондрий (310 мкМ), микросомальный цитохр ом Ь5 крысы (256 мкМ) и рекомбинантный цитохром Р450 3А4 (182 мкМ) были экспр ессир ованы и выделены в Институте биоорганической химии НАН Беларуси.

Спектральные исследования проводили с помощью спектрофотометра Сагу 100 Scan UV-Vis. Электрохимические измерения проводили с помощью потенциостата AUTOLAB PGSTAT12

(Eco Chemie, Нидерланды), снабженного пр о -гр аммным обеспечением GPES. Все измер ения пр оводили пр и комнатной темпер атур е. Электр о химические исследования пр оводили в 0,1 М калий-фо сфатном буфер е, содержащем 0,05 М NaCl, рН 7,4. В р аботе использовали тр ех-контактные электроды, полученные методом тр афар етной печати (ООО НПП ЭЛКОМ, P о с-сия, http://www.elcom-moscow.ru), с гр афитовы-ми р абочим и вспомогательным электр одами (графит фирмы Adison) и хлорсеребряным электр одом ср авнения. Диаметр рабочего электр ода 2 мм. Все потенциалы приведены относительно хлорсер ебр яного (Ag/AgCl) электр ода ср авнения.

Цикловольтампер огр аммы (ЦВА) р егистр ир овали пр и скор о сти р азвертки от 10 до 100 мВ/с. Пар аметр ы, используемые пр и исследовании квадр атно-волновой вольтампер ометр ии (КВВА ): во сстановление - начальный потенциал +0,1 В, конечный потенциал -0,6 В; окисление - начальный потенциал -0,6 В, конечный потенциал +0,1 В; шаг потенциала 0,005 В, амплитуда 0,02 В, частота от 10 до 100 Гц.

Для приготовления электродов на поверхность рабочего гр афитового электр ода наносили 2 мкл 5 мМ коллоидного раствора золота в 0,1 М DDAB в хлор офор ме, по сле и спар ения хлор офор ма (10 мин) наносили 2 мкл исследуемого флавогемопр отеина P450 ВМ 3. Для и с-следования электрохимических параметров ци-тохрома c и цитохрома Ô5 использовали электр оды, модифицированные DDAB (1 мкл 0,1 М DDAB в хлор офор ме). Электр оды о ставляли на 12 ч пр и +4°C во влажной камер е, пр едот -вр ащающей полное высыхание электр одов.

Митохондриальный или микросомальный цитохр ом (1 мкл, 10 мкМ ) был встр оен с мембр ану DDAB на

Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.

Показать целиком