научная статья по теме ИССЛЕДОВАНИЕ ВОССТАНОВЛЕНИЯ КИСЛОРОДА В ФОТОСИСТЕМЕ 1 ВЫСШИХ РАСТЕНИЙ С ПРИМЕНЕНИЕМ ДОНОРОВ ЭЛЕКТРОНОВ ДЛЯ ЭТОЙ ФОТОСИСТЕМЫ В ЦЕЛЫХ ТИЛАКОИДАХ Биология

Текст научной статьи на тему «ИССЛЕДОВАНИЕ ВОССТАНОВЛЕНИЯ КИСЛОРОДА В ФОТОСИСТЕМЕ 1 ВЫСШИХ РАСТЕНИЙ С ПРИМЕНЕНИЕМ ДОНОРОВ ЭЛЕКТРОНОВ ДЛЯ ЭТОЙ ФОТОСИСТЕМЫ В ЦЕЛЫХ ТИЛАКОИДАХ»

БИОЛОГИЧЕСКИЕ МЕМБРАНЫ, 2014, том 31, № 6, с. 427-434

УДК 581.19+577.1

ИССЛЕДОВАНИЕ ВОССТАНОВЛЕНИЯ КИСЛОРОДА В ФОТОСИСТЕМЕ 1 ВЫСШИХ РАСТЕНИЙ С ПРИМЕНЕНИЕМ ДОНОРОВ ЭЛЕКТРОНОВ ДЛЯ ЭТОЙ ФОТОСИСТЕМЫ В ЦЕЛЫХ ТИЛАКОИДАХ

© 2014 г. М. А. Козулева1, Д. В. Ветошкина1, А. А. Петрова2, М. М. Борисова-Мубаракшина1, Б. Н. Иванов1

Институт фундаментальных проблем биологии РАН, 142290 Пущино, Московская обл., Институтская ул., 2;

*электронная почта: ivboni@rambler.ru 2Институт физико-химической биологии им. А.Н. Белозерского Московского государственного университета

им. М.В. Ломоносова, 119991 Москва, Ленинские горы Поступила в редакцию 24.07.2014 г.

Изучено поглощение кислорода на свету в суспензии изолированных тилакоидов гороха при инги-бировании переноса электронов от фотосистемы 2 диуроном и подаче электронов к фотосистеме 1 с помощью искусственных доноров в присутствии аскорбата. Проанализировано влияние аскорба-та и природы доноров на процесс восстановления молекул О2 компонентами акцепторной части фотосистемы 1. Показано, что при изучении этого процесса ДХФИФ не может использоваться в качестве донора для фотосистемы 1. ТМФД как такой донор, по-видимому, не влияет непосредственно на реакцию восстановления молекул О2, поскольку при увеличении его концентрации скорость поглощения кислорода не увеличивалась. В экспериментах с использованием ТМФД повышение интенсивности действующего света приводило к возрастанию скорости поглощения кислорода, что было интерпретировано как следствие увеличения кажущейся константы скорости реакции восстановления молекул О2 компонентами акцепторной части фотосистемы 1 в этих условиях.

Ключевые слова: фотосинтез, хлоропласты, тилакоиды, восстановление кислорода, фотосистема 1.

Б01: 10.7868/80233475514060024

ВВЕДЕНИЕ

Восстановление молекул О2 в фотосинтетической электрон-транспортной цепи (ФЭТЦ) (реакция Мелера), процесс неизбежный в аэробных условиях, протекает в клетках высших растений и водорослей параллельно восстановлению МАЭР+ [1, 2]. Имеющиеся к настоящему времени данные об основных характеристиках реакции Мелера детально описаны в обзорах [3, 4]. В течение более 60 лет со дня опубликования работы Мелера интерес ученых вызывают три вопроса [5]: вклад реакции Мелера в общий перенос электронов по ФЭТЦ, ее физиологические функции и механизм. В последнем случае вопрос состоит в том, какой компонент ФЭТЦ осуществляет восстановление молекулы О2 до супероксидного анион-

радикала, 02-, первого продукта этого восстановления. Установлено, что основным участком ФЭТЦ, где происходит восстановление О2, является акцепторная часть фотосистемы 1 (ФС1) [2, 6, 7]. До сих пор, однако, не известно, один компонент этого участка всегда переносит элек-

трон на молекулу О2 или же от условий функционирования ФЭТЦ, например от интенсивности света, зависит, какой компонент будет основным восстановителем этих молекул.

Поскольку восстановление О2 возможно не только в ФС1, но и в пластохиноновом пуле (ПХ-пул) [8], а в определенных условиях даже на акцепторной стороне фотосистемы 2 (ФС2) [9], при экспериментальном изучении механизма этого процесса в ФС1 необходимо исключить его протекание в указанных участках ФЭТЦ. Фрагменты тилакоидных мембран, содержащих только (или в основном) ФС1 (ФС1-частицы), выделяют с использованием различных способов разрушения тилакоидов (ультразвук, детергенты, различные прессы), что может приводить к модификации акцепторной стороны этой ФС, о чем свидетельствуют различия в характеристиках восстановления кислорода в неповрежденных тила-коидах и в таких частицах. В частицах ФС1 скорость образования О^ была на порядок, а константа скорости реакции второго порядка между О2 и компонентами ФС1 — на два порядка выше,

427

4*

VO2, мкмоль О2/мг Хл в час 300 -

200

100

Í

i

2 ^

> в ■ а

1

0 200 400 600 800 1000 [ТМФД] или [ДХФИФ], мкМ

но, что изучение в такой изолированной ФС1 процесса восстановления МАЭР+ с участием фер-редоксина невозможно из-за окисления восстановленного ферредоксина окисленными формами аскорбиновой кислоты [12]. Нельзя исключить, что в ходе изучения восстановления молекул О2 в частицах ФС1 и в "функционально изолированной" ФС1 компоненты донорной пары могут вмешиваться в этот окислительно-восстановительный процесс. Цель данной работы состояла в изучении возможности использования ДХФИФ и ТМФД в качестве компонентов до-норной пары при исследовании восстановления кислорода в ФС1 неразрушенных тилакоидов и зависимости этого восстановления от интенсивности света.

0

Рис. 1. Зависимость скоростей поглощения кислорода на свету в суспензии изолированных тилакоидов от концентрации ТМФД (1) и ДХФИФ (2) в отсутствие метилвиологена. а, б, в и г — скорости поглощения кислорода в присутствии 50 мкМ метилвиологена при соответствующих концентрациях ТМФД (а и б) и ДХФИФ (в и г).

чем в целых тилакоидах [10, 11]. Нельзя при этом также исключить, что изменение этой константы обусловлено и элиминированием других мест восстановления О2, указанных выше. Создание "функционально изолированной ФС1" при ин-гибировании переноса электронов от ФС2 в ПХ-пул диуроном и подаче электронов в донор-ную часть ФС1 с помощью искусственных доноров, предположительно, не должно влиять на процессы в акцепторной части этой ФС. Такой подход широко использовался для изучения участия разных участков ФЭТЦ в фотофосфорили-ровании, поступлении протонов в люмен тилакоидов и электронного переноса, катализируемого ФС1. В качестве искусственных доноров обычно используют жирорастворимые соединения, легко отдающие и принимающие электроны, такие как дихлорфенолиндофенол (ДХФИФ), диаминоду-рол (ДАД), М,М,№,№-тетраметил-я-фениленди-амин (ТМФД), феназинметосульфат (ФМС), пиоцианин и ряд других. Поддержание их в восстановленном состоянии в процессе эксперимента осуществляется, как правило, аскорбатом в концентрации, на порядок превышающей концентрацию доноров, и служащим резервуаром электронов для восстановления донорной части ФС1. Следует отметить, что аналогичная система, так называемая "донорная пара", применяется и при работе с выделенными ФС1-частицами. Однако и доноры, и аскорбат, будучи активными ре-докс-агентами, потенциально способны влиять на реакции переноса электронов и на акцепторной стороне ФС1. Было, в частности, установле-

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Тилакоиды из листьев 2—3-недельных проростков гороха сорта "Богатырь", выращенного в теплице, выделяли как описано в работе [8] и хранили при 0°C в среде, содержащей 20 мМ NaCl, 5 мМ MgCl2, 50 мМ HEPES-KOH (pH 7.6). Концентрацию хлорофилла определяли в 95% эта-нольном экстракте [13]. Тилакоиды вносили в реакционную среду в количестве, соответствующем концентрации хлорофилла 15 мкг/мл. Реакционная среда объемом 0.22 мл содержала 20 мМ NaCl, 5 мМ MgCl2, 50 мМ HEPES-KOH (pH 7.6), 20 мкМ диурон, 10 мМ аскорбат натрия, ДХФИФ, ТМФД, метилвиологен (Мв) в концентрациях, указанных в подписях к рисункам, и, где указано, 0.4 М сахарозу. Диурон, аскорбат натрия, ДХФИФ, ТМФД, Мв, каталаза и супероксиддис-мутаза (СОД) куплены в фирме Sigma. Реакционную смесь освещали с помощью красного свето-диода (к > 660 нм) светом интенсивностью 500 мкмоль квантов/м2 в секунду; интенсивность света варьировали с помощью нейтральных светофильтров. Фотосинтетически активную радиацию в диапазоне длин волн 400—700 нм измеряли с помощью LI-190SA Quantum Sensor. Содержание О2 в среде измеряли с помощью кларковского рО2 электрода в термостатируемой (t = 21°C) ячейке.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

Влияние доноров ТМФД и ДХФИФ на скорость поглощения кислорода в суспензии тилакоидов в присутствии диурона. Светоиндуцируемое поглощение кислорода в суспензии изолированных тилакоидов в присутствии 3-(3,4-дихлорфенил)-1,1-диметилмочевины (ЭСМи, диурон) практически отсутствует, но в присутствии 10 мМ аскор-бата возрастает до 6 мкмоль О2/мг Хл в час (рис. 1). Таким образом, аскорбат способен сам по себе

выступать в роли донора электронов для окисленного первичного донора электронов в ФС1 (Р700+). Внесение ДХФИФ или ТМФД в суспензию в присутствии диурона и аскорбата почти вдвое увеличивает скорость поглощения кислорода уже при 50 мкМ концентрации этих доноров. При увеличении концентрации ДХФИФ скорость поглощения кислорода возрастает, а случае ТМФД почти не изменяется вплоть до весьма высоких концентраций (рис. 1). Аналогичное различие между ТМФД и ДХФИФ наблюдалось и в тилакоидах из цианобакторий (неопубликованные данные).

При наличии в суспензии каталазы поглощение кислорода на свету уменьшается в 2 раза как в отсутствие, так и в присутствии доноров (не показано). Двукратное уменьшение свидетельствует о том, что оно обусловлено светоиндуцированным переносом электронов, обеспечивающим восстановление молекул О2 до супероксидных радикалов, 02- , вступающих затем в реакции, диктуемые составом среды и приводящие в конечном итоге к образованию пероксида водорода. Процесс описывается следующими уравнениями.

1) Восстановление О2 "через" ФС1 при использовании аскорбата как источника электронов для восстановления Р700+ с/без участием доноров-медиаторов: 2АскН- — 2е- ^ 2О2 .

2) Образование из О^ пероксида водорода, Н2О2, или в реакции 202 + 2АскН- = 2Н2О2 (к = = 3.3 х105М-1с-1 при рН 7.8 [14]), или в реакции дисмутации 202- + 2Н+ = Н2О2 + О2 (к = 105 М-1 с-1 при рН 7.7). От того, какая из этих реакций протекает, зависит стехиометрия между скоростью восстановления О2 и скоростью поглощения кислорода, 1О2 : 1е-, в первом случае, и 0.502 : 1е- — во втором. Следует отметить, что восстановление

О2 до Н2О2 может осуществляться не только ас-корбатом.

3) Разложение пероксида водорода каталазой, катализирующей реакцию 2Н2О2 = 2Н2О + О2, при любом соотношении скоростей реакций, указанных в п. 2, уменьшает количество поглощенного кислорода в 2 раза.

Влияние метилвиологена на скорость поглощения кислорода в ФС1. Метилвиологен (Мв) — эффективный акцептор электронов от кофакторов акцептной части ФС1; константа скорости второго порядка окисления этих кофакторов равна 107 М-1 с-1 [15], а величина Кт составляет 2—3 мкМ

Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.

Показать целиком