ОНТОГЕНЕЗ, 2014, том 45, № 5, с. 355-360
КРАТКИЕ СООБЩЕНИЯ =
УДК 591.169:591.3
ИССЛЕДОВАНИЕ ВОЗМОЖНОГО УЧАСТИЯ MEK МИТОГЕН-АКТИВИРУЕМОЙ ПРОТЕИНКИНАЗЫ И TGF-p РЕЦЕПТОРА В ПРОЦЕССАХ РЕГЕНЕРАЦИИ ПЛАНАРИЙ С ПОМОЩЬЮ ФАРМАКОЛОГИЧЕСКОГО ИНГИБИТОРНОГО АНАЛИЗА
© 2014 г. А. М. Ермаков, О. Н. Ермакова, С. А. Ермолаева
Институт теоретической и экспериментальной биофизики РАН 142290 Пущино, Московская обл., ул. Институтская, д. 3 E-mail: ao_ermakovy@rambler.ru Поступила в редакцию 16.11.13 г.
Окончательный вариант получен 14.03.14 г.
В работе с помощью фармакологического ингибиторного анализа у пресноводных плоских червей планарий Schmidtea mediterranea исследовано возможное участие MEK митоген-активируемой про-теинкиназы и TGF-P рецептора в процессах регенерации и морфогенеза. Показано, что фармакологические ингибиторы данных протеинкиназ приводят к значительному подавлению регенерации головной части животных. При этом данный эффект реализуется за счет ингибирования пролифе-ративной активности стволовых клеток планарий — необластов. Продемонстрировано, что подавление исследуемых протеинкиназ у регенерирующих планарий приводит к значительным нарушениям процессов дифференцировки стволовых клеток и морфогенеза.
Ключевые слова: планарии, регенерация, МЕК и ТОБ-Р протеинкиназы, фармакологические ингибиторы, стволовые клетки, пролиферация, дифференцировка.
DOI: 10.7868/S0475145014050048
Пресноводные плоские черви планарии — уникальный биологический объект для исследований в области биологии стволовых клеток, регенерации и морфогенеза (Gentile et al., 2011). Все биологические свойства планарий зависят от плюри-потентных соматических стволовых клеток — необластов (Baguna, 1981; Newmark, Sanchez Alva-rado, 2000). Эта популяция клеток имеет определенную морфолигию и экспрессирует свойственные ей гены "стволовости", которые во многом схожи с таковыми у млекопитающих (Onal et al., 2012; Labbe et al., 2012). В последнее десятилетие у планарий проводятся исследования молекуляр-но-генетических механизмов регуляции процессов регенерации (Shibata et al., 2010).
Митоген-активируемые протеинкиназы
(MAPK) — эволюционно консервативная внутриклеточная каскадная сигнальная система, которая регулирует множество функций, в том числе пролиферацию и дифференцировку клеток (Yang et al., 2013). Семейство MAPK протеинкиназ включает три подсемейства — это белки p38, JNK/SAPK (c-Jun N-terminal kinase/Stress activated protein kinase) и ERK (Exracellular signal-regulated kinase) (Потехина, Надеждина, 2002). Показано, что во всех случаях активация протеинкиназ
семейства ERK связана с клеточным выживанием и стимуляцией пролиферации, а активация протеинкиназ семейств р38 с индукцией апоптоза (Kyriakis, Avruch, 2012).
С MAPK, а именно звеном белков группы р38, связаны сигнальные каскады трансформирующего ростового фактора (TGF) и его рецептора, которые контролируют клеточную пролиферацию, дифференцировку и апоптоз, а также множество других функций (Heldin et al., 2009). У планарий ERK и сигнальные системы, связанные с TGF на сегодняшний день исследованы слабо, поэтому цель данной работы — исследование возможного участия MEK митоген-активируемой протеинкиназы и TGF-ß рецептора в процессах регенерации планарий Schmidtea mediterranea с помощью фармакологического ингибиторного анализа.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
Животные
Работа выполнена на планариях Schmidtea mediterranea (Platyhelminthes, Triclada), бесполой лабораторной расе плоских червей. Планарий содержали в прудовой воде (смесь отстоянной водопроводной и дистиллированной в пропорции 3/2)
3 4 5 6 7 8 9 Сутки регенерации
Рис. 1. Динамика регенерации головной части плана-рий S. mediterranea в присутствии ингибиторов мито-ген-активируемой протеинкиназы МЕК — PD 98059 и протеинкиназы — рецептора TGF-P — LY 364947.
при комнатной температуре и кормили раз в неделю личинками двукрылых. Для экспериментов по исследованию динамики регенерации отбирали животных длиной около 8 мм или 3—4 мм (для оценки митотической активности необластов) и прекращали их кормление за 7 дней до опытов. Регенерация вызывалась ампутацией 1/5 части тела планарий, содержащей головной ганглий, в области непосредственно за глазами.
Температура воды в экспериментальном и контрольном сосудах поддерживалась одинаковой, на уровне 21 ± 0.5°C. Эксперименты в каждой серии повторялись не менее 3-х раз на группах, включающих в среднем по 30 животных.
Метод прижизненной компьютерной морфометрии
Для оценки динамики роста регенерационной почки (бластемы) использовали метод прижизненной морфометрии планарий (Тирас, Сахарова, 1984). В качестве количественного критерия роста использовали индекс регенерации R = s/S, где s — площадь бластемы, S — площадь всего тела регенеранта. Каждое из измеряемых значений R — результат усреднения измерений по 30 животным. Изменение индекса регенерации оценивали по методу, описанному в работе Ермаковой и сотр. (Ермакова и др., 2009).
Метод иммуногистохимического окрашивания и подсчета количества митотических клеток в теле планарий
Планарий обездвиживали в течение 5 мин в 7% растворе N-ацетил цистеина и фиксировали в 4% растворе формальдегида в ФСБ + 0.3% Tritón X100 в течение 20 мин. Дальнейшие процедуры проводили согласно протоколу, описанному в ра-
боте Ньюмарка и Альварадо (Newmark, Sanchez Alvarado, 2000). Для выявления митотических клеток в теле планарий использовали первичные антитела на фосфорилированный гистон 3 (Santa Cruz, США) в разведении 1/700 и вторичные антитела с флуоресцентным красителем CF488A (Biotium, США) в разведении 1/1000. Планарий после отмывки от вторичных антител помещали в среду для иммунофлуоресценции Vectashield (Vector Labs, США) и микроскопировали с помощью конфокального микроскопа Leica Microsystems SP5 (Германия). Полученные изображения планарий обрабатывали программой ImageJ (NIH, США), с помощью которой производилось 3D моделирование морфологической и анатомической структуры тела планарии. Подсчет митоти-ческих клеток и площади животных осуществляли с помощью программы Axio Image (Carl Zeiss, Германия), далее определяли число митотических клеток на мм2 площади тела животного и усредняли данное значение по измерениям у 10 животных. Изменение митотической активности необластов оценивали по методу, описанному в работе Ермаковой и др. (Ермакова и др., 2009).
Статистическая обработка полученных результатов
Статистическую обработку результатов проводили с помощью программы "Sigma-Plot 9.11" (Systat Software Inc., Германия). Для анализа данных использовали дисперсионный однофактор-ный анализ ANOVA.
Обработка планарий ингибиторами митоген-активируемых протеинкиназ
В работе использовались ингибиторы мито-ген-активируемой протеинкиназы МЕК — PD 98059 (Santa Cruz, США) и протеинкиназы — рецептора TGF-ß - LY 364947 (Santa Cruz, США). Стоковые растворы готовили путем растворения в ДМСО навески препарата до концентрации 10-2 М. Далее стоковый раствор добавляли непосредственно в воду с декапитированными планари-ями до конечных концентраций 10-5 или 10-6 М, которые на стадии предварительных экспериментов были определены как не токсичные. Вода с контрольными группами животных содержала ДМСО в тех же концентрациях, что и раствор с подопытными группами.
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
На рисунке 1 представлена динамика изменения индекса регенерации у планарий с 3 по 9 день после декапитации у контрольных групп плана-рий и подопытных, после воздействия ингибиторов PD 98059 и LY 364947. Данные препараты до-
ИССЛЕДОВАНИЕ ВОЗМОЖНОГО УЧАСТИЯ МЕК 357
Л' I'..- / • « "* 1 V *
-1. ' 1 . - 1 ' ". ■ > * . | | \ \' \ / .■ Ч ■ . . . / \\ в / \
Контроль РБ 98059 ЬУ 364947
500 г
Рис. 2. Ингибирование митотической активности необластов в теле планарий после воздействия ингибиторов PD 98059 и ЬУ 364947. Цена деления на микрофотографиях — 1 мм, * р < 0.001.
стоверно подавляли рост головного конца тела животных. Максимальные эффекты ингибирова-ния наблюдались при концентрациях 10-5 М. Так, эффект подавления роста головной бластемы препаратом РБ 98059 на 3 сутки регенерации составлял —94 ± 8% (р < 0.001), далее он постепенно уменьшался до —52 ± 9% (р < 0.001) к 9 суткам.
При этом в растворах ингибитора МЕК с концентрацией 10-6 М на 3 сут регенерации достоверного эффекта не наблюдали, но уже на 4 сутки проявилось достоверное подавление роста бластемы на —34 ± 13% (р < 0.001). Далее на 5 сутки регенерации эффект составлял —24 ± 9% (р < 0.001) и до 9 дня его значение практически не изменялось.
Рис. 3. Фенотипы, проявляющиеся у планарий после воздействия ингибиторов на 9 день регенерации головной части: (а) — фенотип планарий в норме (у животных нормально регенерировавшая голова и развиты глаза), (б) — инкубация в PD 98059 10-5 М (у планарий бластема практически отсутствует), (в) — инкубация в PD 98059 10-6 М (у животных слабый рост бластемы и формируется только один глаз — наблюдается циклопия), (г) — инкубация в ЬУ 364947 10-5 М (наблюдается рост бластемы, но дифференцировка происходит слабо — отсутствуют глаза), (д) — инкубация в ЬУ 364947 10-6 М (рост бластемы идет практически нормально, но формируется 1 ассиметричный глаз — наблюдается циклопия). Цена деления на микрофотографиях — 1 мм.
Ингибирующая активность ЬУ 364947 на рост головной бластемы наблюдалась при концентрации действующего вещества 10-5 М с максимальными значениями подавления регенерации на 4 день после декапитации (величина составляла —24 ± 9% ($ < 0.001)). Но данный препарат был менее активен, чем РЭ 98059 при той же концентрации и динамика ингибирования ЬУ 364947 в концентрации 10-5 М повторяла динамику при действии ингибитора МЕК в концентрации 10-6 М (рис. 1). Наиболее интересной оказалась динами-
ка подавления роста головной бластемы препаратом ЬУ 364947 при концентрации 10-6 М. Она характеризовалась двумя максимумами ингибирую-щей активности на 4 день (—44 ± 9% ^ < 0.001)) и 7 день регенерации (—28 ± 8% ^ < 0.001)).
При исследовании воздействия препаратов РЭ 98059 и ЬУ 364947 на митотическую активность стволовых клеток планарий
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.