УДК 541.182.642
ИССЛЕДОВАНИЕ ВОЗМОЖНОСТИ СТАБИЛИЗАЦИИ ГИДРОЗОЛЕЙ ЗОЛОТА НЕТИОЛИРОВАННЫМИ ГОМООЛИГОНУКЛЕОТИДАМИ РАЗЛИЧНОЙ ДЛИНЫ И ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТИ
© 2013 г. С. А. Семенов, В. М. Рудой
Институт физической химии и электрохимии им. А.Н. Фрумкина РАН 119071 Москва, Ленинский проспект, 31 Поступила в редакцию 04.02.2013 г.
Исследовано стабилизирующее действие нетиолированных олигонуклеотидов различной длины и последовательности на цитратные гидрозоли золота при введении их как на стадии синтеза (при 37 и 60°С), так и после него. Установлено, что олигонуклеотиды обладают выраженным стабилизирующим эффектом, величина которого не зависит от момента их введения в гидрозоль. (Исключение составляет ситуация, в которой адениновые олигонуклеотиды подвергаются в процессе синтеза гидрозоля воздействию температуры 60°С, — в этом случае они выступают, наоборот, в роли деста-билизатора.) Олигонуклеотиды с небольшой длиной цепи (6-меры) проявляют более сильное стабилизирующее действие по сравнению с 12-мерами. Кроме того, обнаружено, что наибольшим стабилизирующим эффектом обладают адениновые и цитозиновые олигонуклеотиды.
БО1: 10.7868/80023291213050157
ВВЕДЕНИЕ
В последнее время конъюгаты наночастиц благородных металлов (в первую очередь, золота) с биомолекулами привлекают все большее внимание исследователей во всем мире. Перспективы их использования заключаются, с одной стороны, в низкой химической активности и уникальных оптических свойствах металлических наночастиц [1—7], а с другой — в таких свойствах биомолекул как высокая селективность [8] и биосовместимость, что крайне важно для применения в медицине. Кроме того считается [9], что наноча-стицы благородных металлов, во всяком случае, — золота, характеризуются достаточно низкой ток-1
сичностью ; при этом на стадии синтеза можно задавать их форму и варьировать в широком диапазоне размер [3, 5, 6, 11—14].
Функционализованные (в том числе, олиго-нуклеотидами) наночастицы золота уже применяются для создания биосенсоров [8, 15—17], однако для введения их в организм, например, с целью доставки лекарств [18] требуется высокая
1 Вопрос о токсичности наночастиц Au остается в настоящее время в значительной мере открытым, поскольку явно не хватает соответствующих экспериментальных данных, особенно, полученных в условиях in vivo. Достаточно полно и всесторонне состояние этой проблемы рассмотрено в прекрасном обзоре [10].
агрегативная устойчивость их дисперсий в биологических средах с высокой ионной силой.
Как правило, биомолекулы закрепляют на поверхности золота по механизму хемосорбции, за счет имеющихся в их составе или специально введенных тиольных групп [19, 20], однако было показано [21, 22], что достаточно эффективно адсорбироваться на наночастицах золота способны и нефункционализованные (нетиолированные) олигонуклеотиды.
Авторы [22] предложили оригинальную "низкотемпературную" методику синтеза гидрозолей золота, наночастицы которых модифицированы нетиолированными олигонуклеотидами. Целью данной работы было исследование возможностей этой методики и устойчивости получаемых с ее помощью гидрозолей золота к электролитической коагуляции.
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ
В работе использовали олигонуклеотиды (ООО НПФ "Литех"), состоящие из 6 или 12 звеньев аденина гуанина цитозина (О или тимина (Г), см. схему. Ниже эти олигонуклеотиды обозначаются как А6, А12, G6, G12 и т.д.
Пуриновые основания
МИ2
N
аденин
N
Ох
о
^И N МИ
2
гуанин
Пиримидиновые основания
о
И3С
МИ
А.
о
МИ2
А
о
цитозин
Участок цепи олигонуклеотида
Ьо
0
о=р-о.
1
о-
фосфатная группа
дезоксирибоза
0
о=р-оч
1 V
о- ^
Схема. Структурные формулы нуклеиновых оснований; справа — схематическое изображение участка цепи олигонуклеотида.
тимин
Все растворы готовили на дистиллированной воде, дополнительно деионизованной на установке Агшш 611\Р (ВаЛогшз, Германия), с удельной электропроводностью не более 0.060 мкСм/см. Для синтеза гидрозолей золота применяли тригид-рат золотохлористоводородной кислоты и дигид-рат цитрата натрия (оба реагента с содержанием основного вещества >99%, Аего8 Ог§ашс8). В экспериментах по изучению устойчивости золей к коагуляции использовали хлорид натрия марки "ч.д.а." (ГОСТ 4233-77, ООО "ИРЕА 2000").
Как уже было сказано выше, для синтеза гидрозолей золота была использована процедура [22], в основе которой лежит метод Френса [23], но температура реакции понижена до 37°С, а время синтеза увеличено до 24 ч.
Данная методика подразумевает введение оли-гонуклеотида в реакционную систему непосредственно перед добавлением восстановителя (цитрата натрия). Следуя ей, в коническую колбу объемом 50 мл наливали 29.7 мл воды, добавляли 0.3 мл 0.025 М раствора НАиС14 и раствор нагревали на водяной бане до 37°С при постоянном интенсивном перемешивании (скорость вращения мешалки — 600 об/мин). Затем в колбу вводили 0.3 мл 50 мкМ раствора соответствующего олигонуклео-тида, а через 15 мин добавляли 0.6 мл раствора цитрата натрия (1 мас. %) и выдерживали реакционную смесь при температуре 37° С и перемешивании 24 ч. Каждый час в течение первых 5 ч после добавления цитрата натрия, а также спустя 24 ч регистрировали спектр экстинкции синтезируемого золя. Затем золь оставляли остывать до комнатной температуры, не прекращая перемешивания. Синтезированные гидрозоли хранили в холодильнике при температуре 4°С.
Таким же способом были синтезированы гидрозоли золота при 60°С (время синтеза — 5 ч). Кроме того, были синтезированы по той же методике и золи, в которые олигонуклеотиды были введены уже после синтеза. Все синтезированные золи выдерживали в холодильнике не менее суток, прежде чем проводили с ними дальнейшие эксперименты.
Эксперименты по оценке устойчивости золей к электролитической коагуляции проводили по разработанной нами ранее методике [24], основанной на наблюдении за поведением полосы локализованного поверхностного плазмонного резонанса (ЛППР) наночастиц золота в ходе их агрегации. В полиакриловую кювету с крышкой, содержащую 1 мл исследуемого гидрозоля золота, добавляли 1 мл раствора №С1 требуемой концентрации и ее содержимое перемешивали путем встряхивания в течение 10 с. Затем в течение часа записывали спектры экстинкции через заданные интервалы времени.
При коагуляции золя золота в медленном и быстром режимах его спектр экстинкции изменяется по-разному [25]. Для медленной коагуляции характерно образование небольших плотных агрегатов наночастиц, что приводит к появлению длинноволнового крыла у полосы ЛППР (см. рис. 1а), тогда как при быстрой коагуляции формируются разветвленные фрактальные структуры и на спектре появляется выраженная вторая полоса резонансного поглощения (рис. 1б). Таким образом, именно указанное изменение спектра экстинк-ции позволяет говорить о смене режима коагуляции. Согласно нашей методике [24], минимальная концентрация соли, при которой на спектре гидрозоля золота регистрируются два разнесен-
D
0.4
D
0.25
400 600 800 1000
Длина волны, нм
0 400
600 800 1000 Длина волны, нм
12 _1
Рис. 1. Спектры экстинкции золя золота (средний диаметр частиц 34.7 нм, концентрация частиц 7 х 10 мл 1), агрегирующего в режиме медленной коагуляции при концентрации NaCl в растворе 0.35 М (а) и в режиме быстрой коагуляции при концентрации №С1 0.50 М (б).
D
0.075
0.050
0.025
0 250
275
(а)
D
1.5 г
1.0
0.5
300 325 350 0 Длина волны, нм
(б)
2.5 5.0 7.5 10.0 Концентрация С12, мкМ
Рис. 2. (а) — Спектр экстинкции надосадочной жидкости золя золота, наночастицы которого были функционализиро-ваны олигонуклеотидом С12; (б) — зависимость величины оптической плотности на длине волны 275.0 нм от концентрации раствора С12 и соответствующая аппроксимирующая прямая.
ных пика поглощения, считается критической концентрацией коагуляции (ККК).
Спектры экстинкции золей регистрировали с помощью двухлучевого спектрофотометра Evolution 300 (Thermo Electron Corp.) в полиакриловых кюветах с длиной оптического пути 10 мм. Кювету сравнения заполняли деионизованной водой. Скорость сканирования составляла 600 нм/мин, шаг — 1.0 нм, диапазон длин волн — от 400 до 1100 нм.
Для оценки величины адсорбции олигонуклеотидов на поверхности наночастиц Au золи центрифугировали (центрифуга Universal 320 R, Hettich) при скорости вращения ротора 12000 об/мин в течение 30 мин. После этого записывали спектр на-
досадочной жидкости (диапазон — от 190 до 600 нм, шаг — 0.5 нм, скорость — 240 нм/мин) в кварцевой кювете с длиной оптического пути 10 мм. Олигонуклеотиды поглощают свет в ближней УФ-области (см. рис. 2а), поэтому, в соответствии с законом Ламберта—Бера, их концентрацию можно определить по величине оптической плотности на характерной длине волны. Для этого были построены соответствующие калибровочные кривые для олигонуклеотидов C12 (X = = 275.5 нм), C6 (X = 275.5 нм), A6 (X = 259.0 нм), G6 (X = 252.0 нм) и T6 (X = 267.5 нм) путем измерения зависимости оптической плотности D их растворов от концентрации C. Пример такой ка-
D
1.0
800 1000 Длина волны, нм
D
1.0
400
600
• •
V * . t
•
100 нм 1 1
800 1000 Длина волны, нм
Рис. 3. Спектр экстинкции золя золота, синтезированного при 37°С в отсутствие олигонуклеотида, и ПЭМ-изображение его частиц.
Рис. 4. Спектр экстинкции золя золота, синтезированного при 60°C в отсутствие олигонуклеотида, и ПЭМ-изображение его частиц.
либровочной кривой для C12 приведен на рис. 2б. Видно, что в достаточно широком диапазоне концентраций олигонуклеотида зависимость D(C) линейна (коэффициент корреляции R = 0.99985); аналогичные линейные зависимости были получены и для других олигонуклеотидов. С их помощью определяли концентрацию олигонуклеоти-дов, не адсорбировавшихся на поверхности нано-частиц, т.е. находящихся в дисперсионной среде (надосадочной жидкости).
Определение размеров и формы частиц проводили с помощью просвечивающего электронного микроскопа (ПЭМ) EM 300 Philips (Нидерланды) при ускоряющем напряжении 160 кВ. В качестве подложек использовали медные сеточки, покрытые углеродной пленкой. Каплю гидрозоля выдерживали на поверхност
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.