БИОЛОГИЧЕСКИЕ МЕМБРАНЫ, 2012, том 29, № 6, с. 400-413
УДК 577.3
ИССЛЕДОВАНИЕ ВЗАИМОДЕЙСТВИЯ ПИРАЗИНА И ЕГО ПРОИЗВОДНЫХ С ФОСФОЛИПИДНОЙ МЕМБРАНОЙ МЕТОДОМ МОЛЕКУЛЯРНОЙ ДИНАМИКИ
© 2012 г. А. А. Мамонов1, Б. Ф. Щеголев2, В. Е. Стефанов1*
1Санкт-Петербургский государственный университет, 199034, Россия, Санкт-Петербург,
Университетская набережная, 7/9, *электронная почта: vastef@mail.ru 2Институт физиологии им. И.П. Павлова РАН, 199034, Россия, Санкт-Петербург, наб. Макарова, 6
Поступила в редакцию 25.11.2011 г. После доработки 03.04.2012 г.
Проведено сравнительное молекулярно-динамическое моделирование процесса диффузии молекулы пиразина и ее метилпроизводных в фосфолипидный бислой модельной мембраны. Вычислены значения структурных и динамических параметров бислоя, изучен характер их изменений в связи со структурой замещенных пиразинов. Результаты моделирования свидетельствуют в пользу гипотезы о том, что молекулярный механизм биологического действия замещенных пиразинов включает в себя стадию растворения в липидах мембранного бислоя с последующим изменением его свойств, что может обеспечивать взаимодействие с интегральными мембранными белками (например, О-белок-сопряженными рецепторами) как напрямую, так и посредством изменения их липид-ного окружения.
Ключевые слова: алкилпиразины, биомембраны, молекулярная динамика.
Для пиразина — шестичленного ароматического гетероцикла с двумя атомами азота в первом и четвертом положениях — и его метилпроизводных описан ряд физиологических эффектов, преимущественно связанных с их воздействием на половую систему млекопитающих [1]: например, 2,5-диметилпиразин (летучий феромон крыс) ингибирует действие эстрадиола [2], 3,6-диметилпиразин-2-тиол ингибирует эффект больших доз тестостерона [3], содержащиеся в сигаретном дыме пиразин, метилпиразин, этил-пиразин, 2,5-диметилпиразин, 2,6-диметилпира-зин, триметилпиразин и 2-метокси-3-метилпи-разин угнетают функционирование яйцевода и тормозят рост и васкуляризацию эмбриональных тканей [4, 5]. Описано также действие алкилпира-зинов на центральную нервную систему [6]. Следует также упомянуть, что тетраметилпиразин (ТМП), один из компонентов препарата лигу-стразина, выделяемого из экстрата растения Ы-gusticum м>аШеки и применяемого в китайской медицине [7], характеризуется широким спектром фармакологических воздействий и ввиду эндотелий-независимого вазорелаксирующего действия успешно применяется при сердечно-сосудистых заболеваниях, в том числе при инфаркте миокарда и мозга [8]. Говоря о физиологическом и фармакологическом действии алкилпиразинов, следует упомянуть и о том, что они присутствуют во
многих продуктах питания человека. Молекулярные механизмы реализации воздействий, вызываемых пиразинами в живых организмах, детально не изучены, хотя известно, что ТМП способен воздействовать на мембранные АТР-зависимые К+-каналы [9], потенциал-зависимые Са2+-кана-лы и тетродотоксин-устойчивые Ма+-каналы [10]. Предполагается также, что ТМП может непосредственно активировать гладкомышечные а1-адренорецепторы [11]. Имеются данные и о том, что алкилпиразин-опосредованная артериальная релаксация связана с активацией адени-латциклазы и каскада протеинкиназы А (ПКА) [12], причем такая активность изменяется в зависимости от числа заместителей в кольце пиразина. На основании известных данных можно предположить, что, по крайней мере, в некоторых случаях, биологическая активность алкилпиразинов может быть опосредована взаимодействием с мембранными белками. Принимая во внимание гидрофобный характер пиразинов, можно также предположить, что они должны легко растворяться в липидных бислоях биологических мембран, что подтверждается экспериментальными данными, согласно которым ТМП легко проникает через гематоэнцефалический барьер [13], а в условиях in vitro проникает через слизистую оболочку эпителия глотки свиньи [14] и кожу [15] путем пассивной диффузии. В работе [16] была вы-
сказана гипотеза о том, что зависимость биологического действия тетраметил-, триэтил- и тетраэтилпиразина от количества заместителей в кольце обусловлена модификацией свойств мембранного бислоя вследствие растворения молекул метилпроизводных пиразина в нем. Эта гипотеза подтверждена результатами экспериментов по измерению влияния метилпроизводных пиразина на микровязкость и температуру фазового перехода бислоя фосфолипидных липосом [16]. Представляет интерес применение метода молекулярного моделирования к изучению свойств фосфолипидных мембран вследствие процесса диффузии в них молекул алкилпиразинов, а также исследование связи характера этих изменений со структурой алкилпиразинов.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
В настоящей работе с помощью метода молекулярной динамики (МД) проводится сравнительный анализ диффузии простых молекул ал-килпиразинов в гидратированный фосфолипид-ный (ФЛ) бислой, который ранее [17—19] использовался при решении аналогичных задач. Модельная мембрана содержит два типа липидов: дипальмитоилфосфатидилхолин (ДПФХ) и ди-пальмитоилфосфатидилэтаноламин (Д ПФЭ). Выбор модели обусловлен задачей изучения процесса диффузии алкилпиразинов в ФЛ бислой клеточных мембран, в рамках которой данная система может рассматриваться в первом приближении в качестве модели малого участка обобщенной клеточной мембраны, свободной от интегральных белков.
Моделирование методом МД, как и работа, связанная с подготовкой исходных данных и анализом результатов, проведены средствами вычислительного пакета GROMACS 3.3 [20, 21] в UNIX-подобной среде на базе Санкт-Петербургского филиала Межведомственного суперкомпьютерного центра РАН. Для визуализации получаемых в процессе работы результатов применяли пакет молекулярной графики VMD [22]. Использованный протокол моделирования в основном подобен приведенному в работе [23], разработанному для ряда мембранных систем, различающихся соотношением чисел молекул ДПФХ и ДПФЭ.
В основу моделируемой системы положена равновесная гидратированная ФЛ мембрана, содержащая ДПФХ и ДПФЭ в соотношении ~70/30. Для ее построения использовали равновесную гидратированную мембрану из 128 молекул ДПФХ, полученную ранее Marrink et al. [19] в приближении объединенного атома, координатный файл (http://www.ucalgary.ca/~tieleman/download. html), который был отредактирован путем замены 38 случайно выбранных молекул ДПФХ (по 19 на каждой стороне бислоя) на ДПФЭ. Так как два
упомянутые фосфолипида различаются лишь полярной группой, редактирование сводилось к замене радикалов CH3 в холиновых остатках ДПФХ на водород с целью получения ионизованных аминогрупп ДПФЭ и удалению воды. Полученная система была затем гидратирована посредством заполнения доступного объема ячейки моделирования водой путем параллельного переноса блока из 216 молекул воды с координатами из преоптимизированного файла, входящего в состав пакета GROMACS. После анализа координат соответствующих атомов и визуального просмотра в VMD молекулы воды, попавшие в середину бислоя, где они обычно отсутствуют, были обнаружены и удалены. В результате получили мембрану из 90 молекул ДПФХ и 38 — ДПФЭ, гидратированную 5755 молекулами воды. Таким образом, число гидратации составило ~45 молекул воды/липид, что превосходит величину ~27, считающуюся минимально достаточной для корректного описания свойств бислоя [24] при МД моделировании. Для аппроксимации потенциальной энергии системы была применена модификация силового поля GROMOS87, предложенная ранее Berger et al. [25], в которой используется приближение объединенного атома (группы CH2 и CH3 рассматриваются как единые частицы с массами и зарядами, равными суммам соответствующих величин составляющих их атомов, и некоторыми эффективными параметрами потенциала Леннарда—Джонса). В качестве величин зарядов были использованы значения, полученные ранее Chiu et al. [26] из неэмпирического расчета. Топологический файл для ДПФЭ построен путем комбинирования параметризации алкильных цепей ДПФХ и полярной группы пальмитоилолео-илфосфатидилэтаноламина аналогично работе [23]. Для описания воды использовано трехча-стичное приближение точечного заряда (SPC) [27]. Полученную систему затем подвергали процедуре минимизации энергии способом сопряженных градиентов.
Полученная мембрана рассчитывалась в течение нескольких сотен пикосекунд при постоянной температуре (325 К) и постоянном объеме ячейки, так чтобы молекулы воды "подстроились" под бислой, а затем досчитывалась в течение 2500 пс при постоянной температуре (325 К) и полуизотропном баростатировании с нормальной и тангенциальной компонентами давления, равными 1 атм, для достижения равновесия. Интегрирование уравнений движения производилось по алгоритму leap-frog при шаге интегрирования 2 фс. На систему накладывались периодические граничные условия по трем измерениям. Использовали термостат Берендсена [28] с постоянной релаксации 1.0 пс, при этом ФЛ бислой и воду термостатировали раздельно. При полуизотропном баростатировании применяли баростат
10 < 1 2 7
R3 5 N 3 R2
9 48
Пиразин:
2-МП:
2,3-ДМП:
2,5-ДМП:
ТМП:
R1, 2, 3, 4 = H R1 = CH3, R2, 3, 4 = H R1, 2 = CH3, R3, 4 = H R1, 3 = CH3, R2, 4 = H R1, 2, 3, 4 = CH3
Рис. 1. Строение молекул рассматриваемых замещенных пиразинов.
Берендсена [28], в котором использовали два одинаковых значения компонент давления, изотермической сжимаемости и постоянных релаксации, равные, соответственно, 1 атм, 4.5 х 10-5 Па-1 и 2.0 пс. Ван-дер-ваальсовы взаимодействия усекались по радиусу 0.9 нм, с вычислением дисперсионных поправок для давления и энергии. Электростатические взаимодействия разбивали на ближнюю и дальнюю составляющие по радиусу 0.9 нм с вычислением дальнодействующего вклада методом PME [29]. Обновление списка парных взаимодействий производилось каждые 10 шагов интегрирования. Все длины связей ограничивались алгоритмом LINCS [30]. Поступательное движение центра масс компенсировалось на каждом шаге.
Полученную систему, после проверки на равновесность, использовали для расчета ее взаимодействия с рядом простых алкилпиразинов. Для этого были выбраны молекулы следующих алкилпиразинов (рис.
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.