ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫЕ СТАТЬИ
УДК 577.125:582.28
ИССЛЕДОВАНИЕ ВЗАИМОСВЯЗИ МЕЖДУ ЛИГНОЛИТИЧЕСКОЙ И ФОСФОЛИПАЗНОЙ АКТИВНОСТЯМИ ГРИБА ьжттт гюятт
© 2014 г. Д. А. Кадималиев1, В. В. Шутова, В. И. Телятник, В. В. Ревин,
Е. В. Кезина, Т. В. Кудаева
Мордовский государственный университет им. Н.П. Огарева, Саранск Поступила в редакцию 13.11.2013 г.
Исследовано влияние гидрокортизона, фторида натрия и сульфата железа на лигнолитическую и фосфолипазную активности гриба ЬеШтт (Раит) й£ппш ВКМ Б-3616В. Показано, что гидрокортизон и фторид натрия ингибируют активность ферментов лигнолитического комплекса — лакказы (ЕС 1.10.3.2), секреторной пероксидазы (ЕС 1.11.1.7) и Мп-пероксидазы (ЕС 1.11.1.13). Сульфат железа не оказывает существенного влияния на эти ферменты. Снижение активности ферментов лигнолитического комплекса связано с ингибированием активности и изменением субстратной специфичности фосфолипазы А2 (ЕС 3.1.1.4) под влиянием гидрокортизона и фторида натрия. При культивировании Ь. в их присутствии фермент имеет большее сродство к насыщенным, а в присутствии сульфата железа и в контроле — к ненасыщенным жирным кислотам.
Ключевые слова: Lentinus tigrinus, лигнолитические ферменты, фосфолипазы, ингибиторы, биодеградация.
DOI: 10.7868/S0026365614040077
В настоящее время широкое распространение получило исследование биодеструкции лигноцел-люлозных материалов и ксенобиотиков грибами-макромицетами, в том числе базидиомицетами.
Известно, что базидиомицеты (Basidiomycetes) способны эффективно осуществлять деградацию устойчивых к разложению в природе соединений ароматической природы за счет синтеза уникального комплекса внеклеточных окислительных и гидролитических ферментов [1, 2]. Поэтому грибы и их ферменты используют в обесцвечивании бумаги и тканей, при изготовлении биосенсоров и композиционных материалов [3, 4]. С другой стороны, они, наряду с другими микроорганизмами, способны разрушать строительные материалы из древесины [5]. По мнению ряда авторов, важную роль в процессах секреции ферментов во внеклеточную среду играют мембраны и их компоненты — фосфолипиды. Показано, что в биодеградации лигнина и ксенобиотиков фенольной природы наряду с внеклеточным лигнолитическим ферментным комплексом (ВЛФК) участвуют и перекиси липидов [6]. У мицелиальных грибов обнаружена взаимосвязь между физиологической активностью и составом липидов, интенсивностью процессов перекисного окисления липидов (ПОЛ), антиокислительной активностью [7, 8].
1 Автор для корреспонденции (e-mail: cadimded@yandex.ru).
Ранее нами было показано, что в процессе культивирования гриба ЬепИпт й^учпш происходит активация фосфолипазы А2 (РЬА2) (ЕС 3.1.1.4), и было высказано предположение о том, что в результате в примицелиальный слой выделяется большое количество жирных кислот. Под действием липо-оксигеназ и активных форм кислорода происходит образование перекисных радикалов липидов, которые окисляют присутствующие в древесине ингибиторы роста грибов (ароматические соединения, в том числе лигнин). Одновременно мицелий гриба секретирует во внеклеточную среду ферменты лигнолитического комплекса. Все это приводит к повышению доступности ароматических соединений (смол) для действия лигнолити-ческих ферментов [9]. По-видимому, существует зависимость между активностью лигнолитиче-ских и липолитических ферментов, что может регулировать процесс биодеструкции лигноцеллю-лозных субстратов. Изучение взаимосвязи между лигнолитической и фосфолипазной активностями гриба ЬепИпт tigrinus позволит разработать новые препараты для биозащиты строительных материалов. Для подтверждения данного предположения необходимо проведение исследований, посвященных влиянию специфических ингибиторов лигнолитических и липолитических ферментов на физиолого-биохимические характеристики гриба в процессе культивирования.
Показано, что нарушение функционирования гена, кодирующего фосфолипазу, изменяет вирулентность грибов [10]. Гидрокортизон действует опосредовано через специфические внутриклеточные рецепторы, предотвращает активацию фосфолипазы A2, стимулируя образование ее ингибитора — липомодулина, а также вследствие прямого воздействия на клеточные мембраны.
Биосинтез жирных кислот почти у всех организмов заканчивается образованием насыщенных кислот, которые затем подвергаются серии реакций десатурации и удлинения с образованием полиненасыщенных жирных кислот. Поскольку десатура-зы являются железосодержащими ферментами [11], можно предположить, что концентрация ионов железа в среде должна оказывать влияние на синтез полиненасыщенных жирных кислот у грибов. Влияние ионов железа на метаболизм липи-дов, вероятно, также связано с их участием в регуляции синтеза цитрата, роль которого в образовании жирных кислот детально исследована [12, 13].
В литературе широко дискутируются вопросы, связанные с ролью фтора для живых организмов, механизмах влияния фтора и его производных на метаболическую активность. Фтор считается наиболее опасным и наиболее фитотоксичным микро-поллютантом среди других загрязняющих веществ, таких, как СО, SO2, NO2. Одним из возможных механизмов ингибирующего действия фторидов может быть нарушение липидного обмена через каскад биохимических реакций. Например, для ряда организмов экспериментально показано, что они при определенных концентрациях ингибируют активность фосфолипазы А2 [14].
Цель работы заключалась в изучении изменения лигнолитической и фосфолипазной активностей гриба Lentinus tigrinus ВКМ F-3616D в присутствии гидрокортизона, ионов железа и фторид-ионов.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
Гриб Lentinus (Panus) tigrinus, пилолистник тигровый, был выделен на кафедре биотехнологии Мордовского государственного университета имени Н.П. Огарева из сухих плодовых тел гриба, растущих на березовом валежнике в окрестностях г. Саранска, и депонирован во Всероссийской коллекции микроорганизмов как штамм ВКМ F-3616 D.
Инокулят L. tigrinus выращивали на среде Ча-пека—Докса, содержавшей 15 г/л лигносульфона-та. Гриб со скошенного сусло-агара (размер ино-кулюма 1 х 1 см) вносили в конические колбы Эр-ленмейера объемом 500 мл со 100 мл питательной среды и выращивали в течение 4 сут на термоста-тируемых орбитальных шейкерах Enviromental Shaker - Incubator ES - 20/60 (200 об/мин) ("Bio-san", Латвия) при 26°С.
Дальнейший рост продуцента происходил на той же среде с введением ингибиторов, куда вносили 5% инокулята, в течение 3, 6, 9 и 12 сут в тех же условиях, что и инокулят.
В качестве эффекторов использовали (г/л): гидрокортизон - 0.03 и 0.02; Бе8О4 - 0.05 и 0.1; ШБ - 0.05 и 0.1.
Биомассу определяли весовым методом. Белок в культуральной жидкости (КЖ) определяли по методу Бредфорд, используя в качестве стандарта бычий сывороточный альбумин [15]. КЖ освобождали от клеток и определяли лигнолитиче-скую активность.
Лакказную активность регистрировали по окислению пирокатехина [16]. За единицу активности принимали количество фермента, которое за 1 мин при 30°С образует 1 мкмоль продукта. Определение пероксидазной активности проводили по окислению о-дианизидина [17]. За единицу активности принимали количество фермента, которое за 1 мин при 20°С расщепляет 1 мкмоль субстрата. Мп2+-пероксидазную активность определяли по окислению фенолового красного [18].
Определение активности РЬА2 (ЕС 3.1.4.11). Биомассу гриба Ь. И^утиз (50 мг) гомогенизировали с 6 мл 0.05 М ацетатного буфера, рН 5.2; содержащего 0.15 М №С1. После озвучивания смеси ультразвуком (22 кГц) в течение 1-2 мин гомогенат оставляли на 18 ч при температуре 40°С. После подкисления концентрированной НС1 до рН 4.0 раствор гомогената подвергали нагреванию при 70°С в течение 5 мин. Затем гомогенат быстро охлаждали до 40°С, нейтрализовали с помощью 5 н №ОН и центрифугировали при 10000 g 20 мин. Образовавшийся осадок удаляли, а супернатант фильтровали. В отфильтрованном прозрачно-желтом супернатанте определяли содержание белка.
Активность РЬА2 определяли по накоплению свободных жирных кислот методом газовой хроматографии. Реакционная среда содержала 10 мМ трис, 0.05 М №С1, 5-20 мМ СаС12, 0.5 мМ ЭДТА, 0.5% детергент Тритон Х-100, рН 8.0. В качестве субстрата использовали ФХ, выделенный из яичного желтка и очищенный хроматографически с использованием системы хлороформ : метанол : ацетон : ледяная уксусная кислота : вода (40 : 13 : 15 : : 12 : 8, по объему). Для образования мицелл смесь озвучивали ультразвуком в течении 1-2 мин. В инкубационную смесь вносили фракцию с фосфоли-пазной активностью с содержанием белка 1-100 мкг. Гидролиз проводили 1 ч при 37°С. Реакцию останавливали смесью хлороформ : метанол : вода (1 : 2 : 0.8, по объему). Нижнюю фазу упаривали, ФЛ осаждали ледяным ацетоном, в супернатанте определяли содержание свободных жирных кислот.
и
Ч
200 180 160 140 120 100 80 60 40 20 0
Ъ
I
Контроль Гидрокортизон Ре$04 (0.1 г/л) NaF (0.1 г/л)
Гидрокортизон (0.03 г/л) FeSO4 (0.05 г/л) NaF (0.05 г/л)
(0.02 г/л)
Рис. 1. Влияние эффекторов на накопление внеклеточного белка Ь. йр-тш. 1 — 3 сут; 2 — 6 сут; 3 — 9 сут; 4 — 12 сут.
Содержание свободных жирных кислот анализировали методом газожидкостной хроматографии. Метилирование жирных кислот проводили по методу Моррисона и Смита. К сухому остатку приливали 3 мл метанола, 50 мкл трехфтористого бора в метаноле и 10 мкг маргариновой кислоты. Пробирки плотно закрывали и помещали в термостат с температурой 64°C на 1 ч. Затем пробы охлаждали, в каждую пробирку добавляли 1.5 мл воды, 2 мл гексана и 1.5 мл соляной кислоты. Пробирки закрывали, энергично встряхивали 3 мин и центрифугировали в течение 5 мин. Верхнюю фазу, содержащую метиловые эфиры, отбирали и выпаривали в канюле током азота. Метиловые эфиры растворяли в 10 мкл гексана.
Разделение метиловых эфиров жирных кислот проводили на газовом хроматографе Shimadzu GS-2010 Plus ("Shimadzu", Япония) с капиллярной колонкой Omegawax 250 длиной 30 м, внутренний диаметр 0.25 мм, толщина слоя фазы 0.25 мкм. ("Supelco", США). Начальная температура 50°C, через 1 мин движение скорости температуры 20 град/мин до 120°C, затем 4 град/мин до
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.