ВЕСТНИК РОССИЙСКОЙ АКАДЕМИИ НАУК, 2014, том 84, № 1, с. 48-51
ИЗ РАБОЧЕЙ ТЕТРАДИ ИССЛЕДОВАТЕЛЯ
Б01: 10.7868/80869587314010058
В статье рассказывается о работах отечественных биохимиков и физиологов по исследованию антибактериальных свойств лизоамидазного комплекса с целью создания современных препаратов более широкого спектра действия, чем классические антибиотики.
ИССЛЕДОВАНИЯ БАКТЕРИОЛОГИЧЕСКИХ ФЕРМЕНТОВ НА ПРИМЕРЕ ЛИТИЧЕСКОГО КОМПЛЕКСА LYSOBACTER SP.
И.С. Кулаев
Памяти Ольги Андреевны Степной
Исследования бактериолитических ферментов стали особенно злободневными в связи с открытием устойчивости к антибиотикам у многих патогенных бактерий и необходимостью поиска новых средств и подходов в борьбе с патогенными бактериями. Одним из таких подходов оказалось выявление бактериолитических ферментов, убивающих бактерии по совершенно иному механизму, чем пенициллин и другие антибиотики.
Когда стало известно, что антибиотики не являются панацеей от всех патогенных болезней, учёные стали искать другие возможности решения этой проблемы. В частности, в Германии Х. Штольп выявил в клетках Echerichia coli мелкие бактерии — Bdellovibrio bacteriovorus, которые занимали место между клеточной стенкой и цито-плазматической мембраной E. coli и высасывали её содержимое. Клетки E. coli при этом погибали. Казалось, что эти мелкие микроорганизмы способны к антимикробному действию, в том числе в отношении патогенных микробов. Во многих странах начали выделять бактерии, родственные Bdellovibrio bacteriovorus.
/ Ж КУЛАЕВ Игорь Степанович — член-корреспондент РАН, главный научный сотрудник лаборатории биохимии клеточной поверхности микроорганизмов Ин-статута биохимии и физиологии ¿тйЯ^^Ш микроорганизмов им. Г. К. Скря-I бина РАН, профессор кафедры ЯлН^^^^^Н молекулярной биологии биоло-ШШ^ШВ^Ш гического факультета Москов-^И ского государственного универ-I ситета им. М.В. Ломоносова.
Заинтересовались этой проблемой и микробиологи Института биохимии и физиологии микроорганизмов (ИБФМ) РАН. Бывший в то время директором института известный микробиолог академик Г.К. Скрябин дал задание лаборатории В.А. Ламбиной поискать Bdellovibrio bacteriovorus в окрестностях города Пущино. В одной из экспедиций сотрудники лаборатории выявили в реке Оке место, лишённое бактерий, в том числе стафилококков и других патогенных грамположи-тельных бактерий. При детальном рассмотрении оказалось, что это связано не с Bdellovibrio bacteriovorus, а с "нормальными" бактериями, относящимися к семейству Pseudomonas. Было установлено, что эта бактерия убивает Staphylococcus aureus и другие патогенные, но только грамположительные бактерии. Pseudomonas aeruginosa и Proteus vulgaris, вызывающие раневые инфекции, не погибали от действия этой бактерии. Исследования в данном направлении были закрыты для публикаций, так как могли иметь важное оборонное значение.
Г.К. Скрябин подключил к изучению биохимии и физиологии этого микроба не только микробиологов из других лабораторий ИБФМ, но и специалистов по биохимии, включая мой отдел биохимии микроорганизмов, отдел цитологии и ряд других подразделений института. Микробиологи сначала дали этому микроорганизму название Xanthomonas campestris (species), но в дальнейшем оно было заменено на Lysobacter species [1]. В моём отделе трудами М.А. Бобыка, А.И. Северина, Г.В. Абрамочкина и других установлено, что ферментативный комплекс состоит из нескольких ферментов, иммобилизованных на высокомолекулярном полисахариде. Комплекс лизиро-вал клетки грамположительных бактерий, особенно хорошо — стафилококков [1]. Он обладал сильной пептидазной активностью, поэтому ему
ИССЛЕДОВAHИЯ БAКТЕРИОЛОГИЧЕСКИХ ФЕРМЕНТОВ
49
дали название "лизоамидаза". О бактериолитиче-ских ферментах в то время уже было кое-что известно. Первый такой фермент — лизоцим — обнаружил А. Флеминг в 1922 г., ещё до открытия им пенициллина в 1940-х годах. Субстратом лизо-амидазы является такое сложное комплексное соединение, как пептидогликан. В его состав входят как полисахарид (гликан), так и некоторые пептиды. Соответственно, в этом бактериолитиче-ском комплексе есть ферменты, вызывающие его расщепление.
Из расщепляющих полисахариды ферментов в комплекс входит мурамидаза (глюкозамидаза в лизоамидазном комплексе отсутствует), а также мурамоилаланинамидаза, расщепляющая связь между мурамовой кислотой и аланином в пептидной части пептидогликана. Большую долю лизо-амидазного бактериолитического комплекса составляют пептидазы, расщепляющие пептидные связи между аминокислотами, входящими в состав пептидогликана. Пептидаз в лизоамидазе несколько [2]. По свойствам они слабо отличаются одна от другой, но именно благодаря им обусловливается основное бактериолитическое действие ли-зоамидазного комплекса. Микробиологи ИБФМ установили, что лизоамидаза очень быстро разрушает стафилококки, в первую очередь золотистый стафилококк. Другие грамположительные бактерии, так же как некоторые грамотрицатель-ные, медленнее поддаются действию лизоамида-зы. Такие злостные гнилостные патогенные бактерии, как Pseudomonas aeruginosa и Proteus vulgaris, не разрушаются (не лизируются) лизоамидазой.
О.А. Степная с сотрудниками исследовали способность лизоамидазы разрушать вегетативные клетки бактерий, дрожжей, гифы и споры грибов, бактериальные споры. В частности, лизо-амидаза оказалась способна разрушать клетки грамположительных бактерий: S. aureus (79 штаммов), Micrococcus lysodeikticus, Streptomyces azureus, S. chrysomallus, Streptococcus mutans (2 штамма), Peptostreptococcus intermedius, Corynebacterium fla-vum, вегетативные клетки, прорастающие и покоящиеся споры Bacillus subtilis (4 штамма), B. cereus,
B. anthracis (4 штамма). Кроме того, лизоамидаза в сочетании с полимиксином В разрушала клетки грамотрицательных бактерий: Fusobacterium necro-forum, Prevotella melaninogenica, Pseudomonas aeruginosa (6 штаммов) Salmonella marcescens, Pseudomonas putida, Escherichia coli (3 штамма); в сочетании с гентамицином или амикацином лизоамидаза разрушала клетки Proteus vulgaris, P. mirabilis; дрожжи: Saccharomycescerevisia (3 штамма), Torulaspora delbrueckii (2 штамма), Cryptococcus terreus, Phichia fermentes, Pseudozyma fuzformiata, Candida boidinii,
C. azyma, C. catenulata; грибы: Aspergillus terreus, A.japonicus; простейшие — Blastocystis homonis. Таким образом, О.А. Степной с сотрудниками уда-
лось с помощью добавки некоторых антибиотиков расширить спектр действия лизоамидазы.
При участии микробиологов Института прикладной микробиологии, в первую очередь Н.А. Шишковой, было продемонстрировано, что лизоамидаза действует на вторичные и споровые формы сибирской язвы — это стало большим достижением медицинской бактериологии. На опытных мышах установлено, что лизоамидаза и даже её отдельные компоненты действуют на бактерии сибирской язвы как in vitro, так и in vivo. Кроме того, нашей лабораторией впервые на одном объекте — Lysobacter — были изучены в сравнительном аспекте как внеклеточные бактериолитиче-ские ферменты, в частности, входящие в состав лизоамидазного комплекса, так и внутриклеточные [3]. Эту работу провели Б.В. Ситкин и О.А. Степная. Они сравнили бактериолитические внеклеточные и внутриклеточные ферменты бактерии Lysobacter species и показали, что в разных компартментах внутри этой бактерии также имеются бактериолитические ферменты, которые по сравнению с внеклеточными ферментами обладают совершенно другими свойствами. Так, они работают не в кислой среде, как внеклеточные ферменты, а в щелочной, и их набор отличается от набора внеклеточных ферментов. Главное же отличие этих двух пулов ферментов — их функции. Внеклеточные ферменты, в частности, лизоамидаза, выполняют защитную функцию, позволяют организму-"хозяину" успешно бороться с другими обитателями их экологической ниши, в первую очередь участвуют в борьбе за добывание пищи. У внутриклеточных ферментов совершенно иные функции: они участвуют в процессе роста и развития обладающих ими бактерий, а также в структурных перестройках внутри разных орга-нелл клетки, давая материал для построения новых структур за счёт имеющихся старых. Так что они никакого отношения к синтетазному действию не имеют, а усиливают разрушение структур внутри организма.
В последние годы в нашей лаборатории О.А. Степной, Л.А. Ледовой и другими сотрудниками было показано, что лизоамидазные литиче-ские ферменты разрушают клеточные стенки не только бактерий, но также дрожжей и грибов, у которых на поверхности клетки находится не пептидогликан, а хитин и маннопротеиды. В составе лизоамидазы были выявлены и хитиназы, и манноглюканазы, разрушающие эти полисаха-ридные соединения [4, 5]. А среди грибов и дрожжей имеется много патогенных организмов, так что лизоамидаза — мощное оружие в борьбе с ними.
Исходный препарат лизоамидазы широко используется в медицине. Так, было установлено, что он обладает мощным антимикробным действием при лечении стоматологических заболева-
4 ВЕСТНИК РОССИЙСКОЙ AКAДЕMИИ ^УК том 84 № 1 2014
50
КУЛАЕВ
Продуцент
Ферменты
17.-
@Ь2
Полисахарид
Комплекс ферментов и полисахарида
Ь5
© Ь2
Мишень
Тейхоевая кислота
Ь1
Р)+ Ь4 £>М
Пептидогликан
-Я-
t©L2
М Ь1 ©Ь2
Схема действия фермент-полисахаридного комплекса Ьу8оЪа&ег 8р. XL1 на грамположительные бактерии-мишени
ний, применяется также в гинекологии и при лечении ожогов и гнойных ран в хирургии. В частности, лизоамидаза с большим успехом использовалась при лечении воинов-"афганцев", а также раненых в Чечне и других районах боевых действий. Препарат опробовался в 16 медицинских учреждениях, среди них Институт хирургии РАМН, Военно-медицинская академия, ряд военных госпиталей, после чего было получено разрешение Фармкомитета СССР на его использование в медицине. Началось его производство на заводах ферментных препаратов медицинского назначения в Риге и в Вышнем Волочке. Он занесён в справочник М.Д. Машковского как перспективное антибактериальное средство и продавался в аптеках.
Однако многие биохимики выражали неудовлетворённость комплексностью лизоамидазы и нестандартностью
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.