ИЗВЕСТИЯ РАН. СЕРИЯ ФИЗИЧЕСКАЯ, 2015, том 79, № 2, с. 250-255
УДК 537.311:538.971
ИССЛЕДОВАНИЯ ФАЗОВЫХ ПРЕВРАЩЕНИЙ В ТВЕРДЫХ ТКАНЯХ ЧЕЛОВЕЧЕСКОГО ЗУБА ПРИ КАРИОЗНОМ ПРОЦЕССЕ МЕТОДАМИ РАМАНОВСКОЙ МИКРОСПЕКТРОСКОПИИ И ЛЮМИНЕСЦЕНЦИИ © 2015 г. П. В. Середин1, Д. Л. Голощапов1, Tatiana Prutskij2, Ю. А. Ипполитов3
E-mail: paul@phys.vsu.ru
Исследования участков эмали с зарождающимся в них кариозным процессом подтвердили предположения об образовании слабых фосфатов при взаимодействии апатита эмали с органическими кислотами (продуктами жизнедеятельности микроорганизмов). Описанный подход для определения областей твердой ткани зуба с зарождающимся кариозным процессом может быть положен в основу нового подхода диагностики кариеса.
DOI: 10.7868/S0367676515020246
ВВЕДЕНИЕ
Среди задач современной стоматологии установление механизмов образования кариеса — одно из основных научных направлений, при этом предупреждение развития заболевания на начальных этапах его возникновения является весьма актуальной проблемой. Хорошо известно, что первый признак кариозного процесса — это пятно, размер и цвет которого с течением времени подвергается значительным изменениям, что связано с превращениями в структуре и химическом составе эмали в области пятна. Установлено, что в кристаллах апатита, составляющих зубную эмаль, на уровне элементарных ячеек происходят интенсивные ионные замещения, которые ведут к изменению фазового состава минерального комплекса апатита эмали и, как следствие, к нарушению динамического равновесия в механизме минерального обмена, что в конечном итоге является предпосылкой к образованию кариеса [1, 2].
Если образование апатита эмали происходит в соответствии со следующей хорошо известной реакцией
Са(НР04)2 • 2Н20 ^ Са8(Р04)6 • 5Н20 ^
^ Саю(Р04)б(0Н)2, т.е. дикальцийфосфат дигидрат (ЭСРЭ) ^ окто-кальций фосфат ^ гидроксиапатит.
Химические превращения, которые происходят в эмали зуба в процессе возникновения кари-
(1)
1 Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования Воронежский государственный университет.
2 Университет Пуэбла, Мексика.
3 Государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования Воронежская государственная медицинская академия имени Н.Н. Бурденко Министерства здравоохранения Российской Федерации.
еса, значительно сложнее. Замещенный гидроксиапатит (ГАП) — основной компонент минеральной составляющей зубной эмали — может вести себя весьма непростым образом при растворении. Это обусловлено не только способностью ГАП к изоморфным замещениям, но и возможностью участвовать в процессах образования широкого класса фосфатов кальция, растворимость которых выше, чем у ГАП эмали зуба. Так, в ряде работ на основании теоретических представлений были высказаны предположения о том, что на начальных стадиях развития кариеса при деминерализации эмали под действием кислот должно происходить осаждение дикальцийфос-фат дигидрата и фторапатита (ФАП) [3, 4, 5]. Анализ диаграмм растворимости фосфатов [6, 7] показывает, что гидроксиапатит — наиболее стабильная форма фосфата кальция (за исключением фторапатита) при значении рН, близком к нейтральному. Дикальцийфосфат дигидрат, согласно диаграмме [6], становится более стабильным в кислой среде за пределами особой точки, в которой находятся в равновесии два твердых раствора (эмаль и дигидрат дикальцийфосфат). Учитывая эти факты, на основании теоретических расчетов было показано, что вероятность таких фазовых превращений возрастает при низких значениях рН (4.3—5.5). Однако цепочка таких превращений до сих пор не была подтверждена экспериментально прямыми исследованиями развития кариозного процесса.
Следует отметить, что при развитии кариозного процесса элементный состав пораженной области, т.е. степень замещений в ней, изменяется с глубиной проникновения кариеса в эмаль [8]. Это означает, что кариес — это не просто цепь химических превращений при процессах растворения гидроксиапатита. При селективном растворении минералов существует вероятность их переоса-
ждения, что позволяет говорить о возможных обратных процессах роста кристаллов ГАП на пораженных участках твердых тканей зуба. Анализируя сказанное, можно утверждать о недооценке роли органики в процессах развития кариеса, что требует пристального всестороннего ее изучения, поскольку именно органическая составляющая может выступать в роли ингибитора роста кристаллов гидроксиапатита.
Цель нашей работы — исследование методами рамановской и фотолюминесцентной спектро-микроскопии зарождения фазовых превращений в твердых тканях человеческого зуба на начальных стадиях кариозного процесса.
ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
Образец зуба с кариозным очагом, удаленный у пациента по ортодонтическим показаниям при пародонтитах тяжелой степени, был подготовлен следующим образом. Вначале зуб промывали в проточной воде, очищали от зубного налета, поверхность высушивали фильтровальной бумагой. Далее, используя микротом, мы получили срез толщиной ~1 мм. Полученный шлиф приклеили с помощью акрилатного клея на стеклянную пластину толщиной 2 мм. На рис. 1 приведена фотография анализируемого образца, а на вкладке к рисунку более детально показана область кариозной фиссуры.
Как уже было неоднократно показано до нас, наиболее удобным методом для исследования молекулярного строения, а также тонких структурных свойств различного рода объектов, в том числе биологического происхождения, является рама-новская спектроскопия. Используя эту технику неразрушающего контроля, исследователи могут изучить молекулярные колебательные полосы биологических объектов, специфические для конкретных химических групп, что наряду с ИК-спек-тромикроскопией [9] позволяет идентифицировать анализируемое вещество как по структуре, так и по количественному составу. Использование рамановской спектроскопии с включением в измерительную схему оптического микроскопа с хорошим разрешением позволяет получить нужную нам информацию с весьма малой поверхности и, следовательно, объема. Применение рама-новской спектроскопии для анализа твердых тканей зуба, как и применение ИК-спектроскопии, позволило изучить различные аспекты стоматологических исследований, и получить уникальную информацию о молекулярном строении эмали и дентина зубов и способствовало идентификации минеральных фаз, входящих в состав зубной ткани [10, 11].
Рамановские спектры в геометрии обратного рассеяния были измерены при комнатной темпе-
1
г
• V
Рис. 1. Фронтальный шлиф зуба с указанием исследуемых областей; а — общий вид зуба; б — кариозная фиссура. Точки 1 и 2 — области зуба, выбранные для анализа.
ратуре от поверхности образцов по стандартной методике на основе монохроматора TRIAX550 и охлаждаемого жидким азотом ССЭ-детектора. Лазерный луч был сфокусирован на образце с использованием 50-кратного объектива микроскопа, который позволил локализовать пятно лазерного излучения на анализируемой области в пределах 4—8 мкм2. Рассеянный свет от образца был собран и направлен на монохроматор, после чего детектировался ПЗС-матрицей (ССЭ-детек-тор). Мощность лазерного излучения составляла ~30 мВт. Возбуждающее лазерное излучение не было поляризовано, рассеянный свет также был детектирован без поляризации.
Следует отметить, что не менее интересной представляется проблема детектирования начала кариозного процесса. Наиболее развитая из технологий, доступных на сегодняшний день, основана на флуоресцентной спектроскопии. Используя флуоресценцию от твердых тканей зуба, возникновение которой обусловлено облучением эмали светом лазера с длиной волны 488 нм, возможна визуализация областей деминерализации, которые видны как темные пятна на поверхности зуба. В то же время использование света с длиной волны 633 нм позволяет хорошо визуализировать бактериальный налет на поверхности зубов [12].
В нашей работе спектры фотолюминесценции были получены при комнатной температуре от поверхности образцов по стандартной методике на той же самой установке, что и спектры рама-новского рассеяния. Для фокусировки на поверхности использован 10х-объектив. Локальные изменения интенсивности флуоресценции поверх-
252
СЕРЕДИН и др.
Рис. 2. Вид шлифа зуба облученного зеленым лазером
с длиной волны 514.5 нм.
ности образца были удачно проанализированы за счет наблюдения возбужденной флюоресценцию через 514.5 нм режекторный фильтр, что позволило нам хорошо визуализировать более светлые области твердых тканей зуба, имеющие соответственно более высокую интенсивность возбужденной флуоресценции.
РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ
Используя методику возбуждения флуоресценции от твердых тканей зуба, мы исследовали области эмали с кариозной фиссурой. На рис. 2 приведено изображение образца человеческого зуба, облученного зеленым лазером с длиной волны 514.5 нм. Наблюдение возбужденной флюоресценции, как уже было описано ранее, выполнено через 514.5 нм режекторный фильтр. При анализе полученных экспериментальных результатов (см. вкладку к рис. 2) видно, что вокруг областей кариозной фиссуры (темные пятна) хорошо визуализируются более светлые области твердых тканей зуба (на вкладке рис. 2 обозначены стрелкой), имеющие соответственно более высокую интенсивность возбужденной флуоресценции. Это интенсивное свечение вокруг кариозной фиссуры, отличается по цвету и интенсивности от излучения всей засвеченной области интактной эмали и имеет латеральные размеры сопоставимые с размерами фиссуры.
Известно, что межпризменные пространства зуба заполнены биополимерами, представленными, кроме нейтральных гликопротеинов, низкомолекулярными катионными белками с характерным спектром аминокислот (лизин, аргинин, ги-стидин), а также гиалуроновой кислотой [13]. При начальных стадиях развития кариозного процесса в зоне, прилегающей к очагу деминерализации, должна происходить потеря биополимеров и гиа-луроновой кислоты, что вызовет деорганизацию неорганического матрикса в твердых тканях зубов.
Это предположение находится в хорошем соответствии с уже полученными нами данными методами ИК
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.