ГЕНЕТИКА, 2014, том 50, № 4, с. 400-412
= ГЕНЕТИКА МИКРООРГАНИЗМОВ =
УДК 575.2:579.841.31
ITS-ПОЛИМОРФИЗМ СОЛЕУСТОЙЧИВЫХ И СОЛЕЧУВСТВИТЕЛЬНЫХ ПРИРОДНЫХ ШТАММОВ Sinorhizobium meliloti - СИМБИОНТОВ ЛЮЦЕРНЫ, ДОННИКА И ПАЖИТНИКА © 2014 г. М. Л. Румянцева1, В. С. Мунтян1, А. Менгони2, Б. В. Симаров1
1Всероссийский научно-исследовательский институт сельскохозяйственной микробиологии Российской академии сельскохозяйственных наук, Санкт-Петербург-Пушкин 196608 e-mail: mroumiantseva@yandex.ru, genet@yandex.ru 2Университет г. Флоренция, кафедра эволюционной биологии, Флоренция, 50019 Италия
e-mail: alessiome@unifi.it Поступила в редакцию 08.08.2013 г.
Полиморфизм rrs-rrl рибосомальных оперонов (межгенная последовательность, ITS) изучен у 81 изолята Sinorhizobium meliloti (АК001—АК210) из коллекции лаборатории генетики микроорганизмов ВНИИСХМ с применением видоспецифичных праймеров FGPS1490/FGPL132VM. Изоля-ты были выделены из клубеньков разных видов дикорастущих растений-хозяев, относящихся к родам Medicago, Melilotus и Trigonella и произраставших в засоленном северо-западном районе Казахстана. Структура ITS, характерная для штамма Rm1021, была доминирующей в природной популяции ризобий, однако у трети изолятов (33.3%) эти последовательности были дивергентными. Среди последних структура ITS, выявленная у АК83 (RCAM00182), была также доминирующей. Между изолятами, различавшимися по устойчивости к 0.6 M NaCl, не выявлено филогенетических различий, однако частоты встречаемости дивергентных ITS у фенотипически различных групп ри-зобий зависели от хозяйской предпочтительности при формировании симбиоза в естественных условиях. Сделано заключение, что в популяции клубеньковых бактерий в центре интрагрессивной гибридизации люцерн, подверженном засолению, происходят микроэволюционные процессы, затрагивающие rrn-опероны и направленные на изменение адаптационного потенциала микросимбионтов.
DOI: 10.7868/S0016675814040109
Бактерии БтогЫгоЪшш (синоним Ет/еМ) теШоИ являются типичными почвенными бактериями, способными формировать азотфиксирующие клубеньки на корнях растений люцерны, донника и пажитника, относящихся к одной перекрестно-инокулируемой группе [1, 2]. Симбиотическая эффективность растительно-микробных систем зависит от генотипических характеристик растения-хозяина и штамма-микросимбионта, что особенно ярко проявляется под воздействием абиотических стресс-факторов [3—6].
Штаммы Б. теШоИ имеют изначально высокий уровень устойчивости к засолению. Показано, что в лабораторных условиях 70% природных штаммов (изолятов) устойчивы к 0.55—0.75 М №С1, тогда как оставшиеся 30% показывают, как правило, ослабленный рост при 0.6 М №С1 в питательной среде [7]. Следует отметить, что даже сниженный уровень солеустойчивости природных штаммов по-прежнему существенно выше уровней устойчивости у таких видов, как ЕН^оЫ-ит ^ыттозатт Ъу. утае, ВН. ^ыттозатт Ъу. М/оШ, ВН. leguminosarum Ъу. рказеоН, BradyrhizoЪi-ит ]аротеит [8, 9]. Ранее нами было показано,
что солеустойчивые и солечувствительные изоля-ты Б. теШоИ достоверно различались по симбио-тической эффективности и структурному полиморфизму Ъе?-генов, участвующих в синтезе ос-мопротекторов [10]. Вместе с тем анализ фенотипически различных групп природных штаммов по генотипическим маркерам, используемым для изучения филогенетического родства, ранее не проводился.
Наибольшую популярность в таких исследованиях последних десятилетий получил анализ нук-леотидного полиморфизма генов, кодирующих субъединицы 168, 238 и 58 рибосом, входящих в один ггп-оперон [11]. Последовательность гена 168 рРНК была выбрана в качестве "золотого стандарта" для идентификации и таксономии различных видов бактерий [12—14]. Рибосомаль-ные гены, согласно теории "нейтральной молекулярной эволюции", эволюционируют через точечные мутации, поэтому распространение новых аллелей в популяции происходит через случайный дрейф генов, а не за счет диверсификации дарвиновского отбора [14].
Изучение внутривидового полиморфизма последовательности рибосомального оперона привело к разработке метода риботипирования, который успешно использовали для классификации бактерий [15]. Особый интерес представляют исследования по изучению активности rrn-оперо-нов под воздействием абиотических стресс-факторов [16], что может указывать на то, что эти опе-роны вовлечены в процессы регулирования адаптационного потенциала микроорганизмов.
Наиболее простым, быстрым и экономичным способом изучения полиморфизма rrn-оперонов на меж- и внутривидовом уровнях стал анализ последовательности между генами 16S рРНК (rrs) и 23S рРНК (rrl), обозначенной как ITS (Internal Transcribe Sequence) [17—19]. Недавно было показано, что природные штаммы, выделенные в различных эколого-климатических регионах, достоверно различались по структурам ITS. Кроме того, были выявлены последовательности, не описанные ранее, для бактерий рода Bradyrhizobi-um [20, 21].
Амплификацию последовательностей ITS проводят, чаще всего, с использованием так называемой "универсальной" пары праймеров FGPS1490/FGPL132 [22]. В результате за последние десятилетия была получена обширная база данных о полиморфизме ITS участков у разных видов/родов бактерий [18, 20—38]. Вместе с тем комплементарность "универсальной" пары праймеров к соответствующим rrn-оперонам тест-штамма Rm1021 S. meliloti, а также полиморфизм этих последовательностей в природных популяциях клубеньковых бактерий люцерны в центрах разнообразия растений-хозяев ранее не исследовались.
В настоящей работе представлены результаты изучения последовательности между генами 16S рРНК и 23S рРНК у 81 природного штамма S. meliloti, различавшихся по солеустойчивости и хозяйской специфичности (симбионты разных растений-хозяев), которые были выделены в районе разнообразия люцерн в Приаралье, подвергшемся засолению. Изучаемые штаммы являются частью коллекции природных штаммов (АК001— АК210) лаборатории генетики микроорганизмов ГНУ ВНИИСХМ, которые, в свою очередь, были объектом исследования по грантам INCO—Copernicus ICA2-CT-2000-10001 и QLK3-CT-2002-02097 ("Bacdivers") [3, 5, 7, 10, 39].
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
В работе использовали случайно отобранную выборку из 81 изолята S. meliloti, изначально выделенных из клубеньков дикорастущих растений люцерны — Medicago (M. varia, M. falcata, M. trau-tvetteri и M. lupulina), донника — Melilotus spp. и па-
житника — Trigonella spp., произраставших в предгорье Мугоджары, Северный Казахстан (Приаралье) [3, 10]. Этот район является современным центром интрагрессивной гибридизации люцерны [40, 41] и подвержен вторичному засолению. Соотношение штаммов-симбионтов Medicago, Melilotus и Trigonella в выборке составило 59 : 12 : 10, соответственно. Анализируемые штаммы различались по устойчивости к 0.6 M NaCl в среде выращивания TY [42], согласно [3, 10].
В качестве тест-штаммов использовали Rm1021 [43] и АК83 £ meliloti [44, 45], последний принадлежит к изучаемой коллекции природных штаммов S. meliloti и депонирован под номером RCAM00182 в Ведомственной коллекции полезных микроорганизмов сельскохозяйственного назначения Россельхозакадемии (RCAM).
Анализ ITS проводили с помощью ПЦР-RFLP. Геномную ДНК штаммов выделяли модифицированным методом фенол/хлороформной экстракции [46]. При постановке ПЦР использовали праймеры FGPS1490/FGPL132VM (см. Результаты и обсуждение). Реакцию ставили в 20 мкл согласно стандартной методике в амплификаторе MyCycler™ фирмы "Bio-Rad" (США) с режимом амплификации: 95°С - 3 мин; 94°С - 30 с, 55°С -30 с, 72°С — 1 мин (30 циклов), заключительная элонгация 72°С — 5 мин [47]. В каждом анализируемом случае были амплифицированы фрагменты ДНК одного размера (см. Результаты и обсуждение). Продукты амплификации обрабатывали эндонуклеазами HaelII или MspI ("Fermentas", MBI, Литва). Электрофоретическое разделение фрагментов ДНК проводили в 3%-ном агарозном геле в ТАЕ буфере pH 8.5 в течение 3 ч [48].
Рестрикционный профиль, полученный при обработке общей ДНК каждого штамма эндо-нуклеазой MspI или HaeIII, являлся его RFLP-ти-пом, обозначенным одной строчной буквой латинского алфавита. При рассмотрении двух RFLP-типов каждому изоляту присваивали соответствующий RFLP-тип: "аа" или "ас" или "bb" и т.д., при этом тип "а" или "аа" всегда был аналогичен рестрикционному профилю Rm1021 [48].
В качестве показателей неоднородности и изменчивости популяции ризобий были использованы соответственно коэффициент гетерогенности Нея (N) [49] и индекс видового разнообразия — индекс Шеннона (Н) [50—52]; связь признаков "солеустойчивость" и "ITS-полиморфизм" оценивали согласно корреляционному анализу (F-критерий Фишера), обобщающему критерию хи-квардрат — критерий Мантеля-Хензеля, которые вычисляли с использованием он-лайн ресурса OpenEpi [53]. Кластерный анализ был выполнен посредством вычисления матрицы Евклидова подобия между ITS-RFLP профилями штаммов S. meliloti [51, 52]. Однофакторный анализ прово-
Таблица 1. Комплементарность "универсальных" праймеров FGPS1490/FGPL1321 к ITS-последовательностям штамма S. meliloti Rm1021
Праймер Комплементарный комплекс с ДНК-мишенью Последовательность праймера/последовательность при допуске трех замен* Температура плавления, °C
тип координаты на хромосоме
FGPS1490 специфичный к rrs 83231-83250 2810004-2810023 3212858-3212877 5'-tgcggctggatcacctcctt-3' 64
неспецифичный 381515-381534 3175024-3175043 3610602-3610621 764343-764362** 5'-DgcgScWggaDMRcctYStY-3' 62-68
FGPL132 специфичный к rrl - 5'-ccgggtttccccattcgg-3' 61
неспецифичный 2808717-2808734 (rrl) 3211571-3211588 (rrl) 84520-84537 (rrl) 350447-350464 1902697-1902714 2862809-2862826 3127382-3127399 1609711-1609728 2278711-2278728 2367659-2367676 310019-310036*** 5'- SYVSSYtKYYcBRYtMSV-3' 56-64
Примечание. 1 — см. текст; * — нуклеотидные замены в последовательностях праймеров, приводящие к образованию комплементарных комплексов с ДНК-мишенью, выделены прописными буквами и приведены согласно ИЮПАК; ** и *** — комплексы на мегаплазмиде, соответственно 8Ма и 8МЪ.
дили с применением пакета программ MS Exc
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.