= ГЕНЕТИКА =
УДК 575.17:597.553.2
ИЗМЕНЧИВОСТЬ ГЕНА ЦИТОХРОМА b МИТОХОНДРИАЛЬНОЙ ДНК ГОРБУШИ Oncorhynchus gorbuscha (Walbaum) ИЗ РЕК МАТЕРИКОВОГО ПОБЕРЕЖЬЯ ОХОТСКОГО МОРЯ И ОСТРОВА ЗАВЬЯЛОВА
© 2013 г. Л. Т. Бачевская, В. В. Переверзева
Институт биологических проблем Севера ДВО РАН, 685000 Магадан, ул. Портовая, 18
E-mail: gekki54@mail.ru Поступила в редакцию 08.02.2012 г.
Получены данные о строении и изменчивости нуклеотидной последовательности фрагмента гена цитохрома b (cytb) митохондриальной ДНК (мтДНК) у горбуши смежных поколений из рек материкового побережья Охотского моря и острова Завьялова. Между смежными поколениями обнаружены отличия. По исследованному маркеру горбуша линии четных лет характеризуется более высоким уровнем генетической изменчивости. Показано, что репродуктивная изоляция привела к накоплению конкретных мутаций гена cytb мтДНК в каждой линии и, как следствие, к их дивергенции. Анализ данных показал, что на долю внутрипопуляционной генетической изменчивости североохотоморской горбуши приходится около 91%. Межгрупповой компонент, рассчитанный для смежных поколений вида, относительно невелик и составляет 9%, что, по-видимому, свидетельствует об относительно недавней дивергенции смежных поколений горбуши.
DOI: 10.7868/S0002332913010049
Горбуша Oncorhynchus gorbuscha (Walbaum) обладает одним из самых обширных ареалов среди других видов тихоокеанских лососей. Ее внутривидовая структура имеет иерархический характер, который определяется жестким двухлетним циклом поколений линии четных и нечетных лет. Многие исследователи полагают, что горбуша дифференцирована на ряд изолированных друг от друга самовоспроизводящихся группировок, приуроченных к районам нереста (Beacham et al, 1985; Алтухов, 1989; Алтухов и др., 1997). Другие склоняются к тому, что она имеет слабую межпо-пуляционную дифференциацию в результате периодически возникающих крупномасштабных межрегиональных миграций (Глубоковский, Жи-вотовский, 1986; Животовский и др., 1989; Глубоковский, 1995). Есть мнение, что стада горбуши регулярно обмениваются большим количеством мигрантов, т. е. являются панмиксными (Aspin-wall, 1974). В настоящее время накоплен большой массив данных по этому вопросу, но дискуссия по-прежнему продолжается. В то же время большинство исследователей едины в том, что для горбуши характерны линии четных и нечетных лет, каждая из которых является самовоспроизводящейся единицей. Основная доля межпопуля-ционной генетической изменчивости вида связана с различием двух репродуктивно изолированных поколений (Алтухов и др., 1983, 1997;
Глубоковский, 1995; Калабушкин и др., 1998; Гор-деева и др., 2006; Салменкова и др., 2006; Пусто-войт, 2011). Для расширения представлений о генетической структуре горбуши все чаще применяются молекулярно-генетические методы, среди которых большую ценность приобретает изучение строения митохондриальной ДНК (мтДНК) и микросателлитных локусов ядерной ДНК (Полякова и др., 1992, 1996; Брыков и др., 1999; Гордеева и др., 2006; Салменкова и др., 2006; Шпигальская и др., 2009). Проводимые исследования не всегда дают однозначные результаты. Анализ рестрикционного полиморфизма фрагментов мтДНК горбуши о. Сахалин, Курильских о-вов и Камчатки показал значительные различия в неперекрывающихся поколениях как по уровню изменчивости мтДНК, так и по величине внутривидовой структурированности (Брыков и др., 1999). В то же время исследование разнообразия горбуши по микросателлитным локусам ядерной ДНК позволило выявить относительно невысокий уровень генетической дифференциации репродуктивно изолированных линий поколений четных и нечетных лет данного вида (Салменкова и др., 2006). В настоящее время молекулярно-ге-нетическими исследованиями охвачены популяции горбуши указанных регионов. Горбуша, заходящая на нерест в реки материкового побережья Охотского моря, в этом плане практически не
Рис.1. Карта-схема района сбора материала.
изучена. В последнее время для популяционно-генетических исследований тихоокеанских лососей применяется скрининг нуклеотидных последовательностей генома, дающий исчерпывающую информацию о его строении. Подобный подход в исследовании мтДНК у горбуши представляется весьма перспективным. МтДНК является удобным молекулярным маркером для фило-географических исследований. Относительно высокая скорость накопления мутаций определяет достаточно высокую скорость дивергенции популяций, что дает возможность не только реконструировать (в общих чертах) историю формирования популяционной структуры, но и оценить некоторые демографические процессы, происходившие в популяциях. В связи с этим была по-
ставлена цель — определение изменчивости нук-леотидной последовательности гена цитохрома Ь (суЩ мтДНК и изучение молекулярной эволюции североохотоморских популяций горбуши.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
В основу работы положены материалы, собранные в период анадромной миграции горбуши (2008—2010 гг.). Выборки получены от производителей репродуктивно изолированных генераций четных и нечетных лет. Исследовано четыре популяции, заходящие на нерест в реки материкового побережья северной части Охотского моря и о-ва Завьялова. Район сбора проб представлен на рис. 1. Он ограничен следующими координатами:
Таблица 1. Частота распределения гаплотипов гена суЛ мтДНК в исследованных популяциях горбуши
Локальность Гаплотип
G1 G2 G5 G7 G8 G10 G11 G12 G13 G16 G17
р. Ола 0.4333 0.4733 0.0133 0.0467 0.0067 0.0000 0.0000 0.0133 0.0000 0.0000 0.0067
р. Яна 0.3144 0.5143 0.0382 0.0476 0.0095 0.0000 0.0000 0.0000 0.0095 0.0000 0.0000
р. Рассвет 0.2272 0.6363 0.0000 0.0000 0.0000 0.0455 0.0455 0.0000 0.0000 0.0455 0.0000
р. Тауй 0.5953 0.3333 0.0000 0.0238 0.0000 0.0000 0.0000 0.0000 0.0000 0.0000 0.0000
Локальность Гаплотип
G18 G22 G23 G24 G25 G26 G27 G28 G29 G30
р. Ола 0.0000 0.0000 0.0000 0.0000 0.0000 0.0000 0.0000 0.0000 0.0000 0.0067
р. Яна 0.0095 0.0000 0.0000 0.0095 0.0095 0.0095 0.0095 0.0095 0.0095 0.0000
р. Рассвет 0.0000 0.0000 0.0000 0.0000 0.0000 0.0000 0.0000 0.0000 0.0000 0.0000
р. Тауй 0.0000 0.0238 0.0238 0.0000 0.0000 0.0000 0.0000 0.0000 0.0000 0.0000
149—151°30' в.д. 59—59°46' с.ш. Изучена изменчивость нуклеотидных последовательностей гена cytb мтДНК. Выделение и очистка ДНК проводилась по модифицированному методу Флеминга и Кука (Fleming, Cook, 2002). Участок гена cytb ми-тохондриального генома амплифицировался с использованием праймеров L 15436 (5'- CCT GCT CGG ACT TTA ACC GAA ACT-3') и H15149ad (5'-GCICCTCARAATGAYA TTTGTCCT-3') (Russell et al., 2000). Полимеразная цепная реакция осуществлялась по методике, описанной Миллером (Miller et al.,1998). Выявление нуклеотидных последовательностей амплифицированных фрагментов мтДНК проведено с использованием праймера L15436 наборов для циклического се-квенирования ДНК Big Dye Terminator (Applied Biosystems, v. 3.1, США) и генетического анализатора ABI Prism 3130 (Applied Biosystems). Все нук-леотидные последовательности депонированы в GenBank. Статистическая обработка полученных данных проводилась с использованием пакета программ MEGA-4 (Tamura et al., 2007). Медианную сеть гаплотипов строили с помощью Network 4.5.1.0 (Bandelt et al., 1999). Генетическое разнообразие (нуклеотидное — п) и (гаплотипическое — h) рассчитывали по Неи (Nei, 1987) и Хедрик (2003). Достоверность различия показателя генетического разнообразия исследованных популяций определяли с помощью t-критерия Стьюдента (Лакин, 1990). Анализ межпопуляционной (Fsc) и внутри-популяционной (Fct) генетической дисперсии проводили с использованием программы AMOVA (Analysis of Molecular Variance) в пакете программ ARLEQUIN 3.0 (Excoffier et al, 2005).
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
Определена нуклеотидная последовательность участка гена cytb мтДНК у североохотоморской
горбуши из рек Ола, Яна, Тауй, ручей Рассвет (о-в Завьялова). Изученный фрагмент содержит 449 пар нуклеотидов (пн) и соответствует положению 15471—15919 пн полного генома мтДНК горбуши (GenBank, GB NC010959, EF455489). В процессе изучения этого вида был обнаружен полиморфизм указанного фрагмента митохондриального генома. В исследованных выборках выявлен 21 гаплотип (табл. 1). Все варианты гена cytb мтДНК зарегистрированы в GenBank. Обнаруженные нуклеотидные замены в гаплотипах анализируемого фрагмента cytb горбуши из некоторых рек материкового побережья Охотского моря и о-ва Завьялова представлены на рис. 2. Позиции вариабельных нуклеотидов приведены в сравнении с нуклеотидной последовательностью гаплотипа G1 (GenBank JF313905). При анализе нуклеотидных последовательностей отмечено, что количество замен в третьем положении кодо-на гена cytb более чем в два раза превышает их количество в первом (рис. 2). Такое проявление вполне закономерно. Известно, что третий нук-леотид большинства кодонов в транслируемых участках гена наиболее вариабелен из-за вырожденности кода (Zardoya, Meyer, 1996). В процессе исследований отмечено, что трансверсии встречаются в несколько раз реже, чем транзиции (рис. 2). Нами обнаружена нуклеотидная замена (трансверсия в позиции 139), приводящая к гомоплазии (рис. 3). Выше отмечено, что изученные популяции горбуши представлены 21 гаплотипами. Они не совсем одинаково распределяются в выборках исследованных генераций. Например, у горбуши из р. Ола в 2009 г. (нечетное поколение) отмечено всего лишь три варианта гена cytb, а в выборке четного поколения — семь гаплотипов. Следует подчеркнуть, что некоторые варианты изученного фрагмента гена cytb обнаружены только в четном (10 гаплотипов) или нечетном (8 гаплотипов)
31 JF313905
32 JF313906 Э5 JF313909 Э7 JF313911 ЭБ JF313912
310 JF313914
311 JF313915
312 JF313916
313 JF313917
316 JF313920
317 JF313921 Э1Б JF313922
322 JN227671
323 JN227672
324 JN227673 Э25JN227674
326 JN227675
327 JN227676 Э2Б JN227677 Э29JN22767Б Э30 JN227679 AJB314562 EF4554Б9 N0010959 FJ43560Б
О. ке1а FJББ7Б36
1 1 1
4 7 Б 9 0 2 3
1 5 Б 1 9 6 5
А Т Э Э А А С
Э*" Э
1
3 9 С
А#"
А#" А#"
111 111 455 ББ9 439 065
АСС А А С
1 9 7 А
2 2 2 024 1 Б 0 Т
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.