БИОЛОГИЯМОРЯ, 2013, том 39, № 4, с. 272-280
УДК 575.174;575.174.015.3;597.553.2 ПОПУЛЯЦИОННАЯ ГЕНЕТИКА
ИЗМЕНЧИВОСТЬ МИКРОСАТЕЛЛИТНЫХ ЛОКУСОВ В ПОПУЛЯЦИЯХ НЕРКИ ONCORHYNCHUSNERKA (WALBAUM, 1792) ВОСТОЧНОГО ПОБЕРЕЖЬЯ КАМЧАТКИ
© 2013 г. О. А. Пильганчук1, Н. Ю. Шпигальская1, В. В. Савенков1, О. Н. Сараванский1, Г. В. Базаркин1, А. Н. Ельников2
1Камчатский НИИрыбного хозяйства и океанографии, Петропавловск-Камчатский 683000;
2Всероссийский НИИрыбногохозяйстеа и океанографии,Москва 107140 e-mail:pilganchuk.o.a@kamniro.ru
Статья принята к печати 20.09.2012 г.
Исследована аллельная изменчивость восьми микросателлитных локусов (OtslOl, Ob'la, Okilb, OnelOA, 0ne\09, OtsG6%, OtsG%5, OkiG) в популяциях нерки Oncorhynchus nerka (Walbaum) восточного побережья п-ва Камчатка. Установлено, что выборки из водоемов северной части исследуемого региона - Карагинского и Олюторского районов - характеризуются меньшим числом аллельных вариантов и более низкими оценками ге-терозиготности, чем выборки из бассейна р. Камчатка. По большинству локусов во всех выборках наблюдалось соответствие распределению Харди-Вайнберга. Среднее значение величины межпопуляционной дифференциации (9J по восьми локусам составило 2.93%, что соответствует статистически значимому уровню. Наиболее высокополиморфные локусы для проанализированных выборок оказались наименее дифференцирующими.
Ключевые слова: нерка, микросателлитная ядерная ДНК, популяционно-генетическая изменчивость.
Microsatellite DNA variation in sockeye salmon Oncorhynchus nerka (Walbaum, 1972) populations of eastern Kamchatka. O. A. Pilganchuk1, N. Yu. Shpigalskaya1, V V. Savenkov1, O. N. Saravansky1, G. PT Bazarkin1,A. N. Elnikov2 ('Kamchatka Research Institute of Fisheries and Oceanography, Petropavlovsk-Kamchatski 683000; 2Russian Federal Research Institute ofFisheries and Oceanography, Moscow 107140)
The allelic variations of eight microsatellite loci (OtslOl, Ob'la, Okilb, OnelOA, CW109, OtsG69>, OtsG%5, and Ob'6) were examined in sockeye salmon Oncorhynchus nerka (Walbaum) populations of eastern Kamchatka. Samples from river basins of the Karaginskiy and Olyutorskiy districts in the northern part of the investigated region are characterized by having a smaller number of alleles and lower heterozygosity, compared to samples from the Kamchatka River basin. There was a fit to the Hardy-Weinberg distribution at most of the loci surveyed in all samples. The average differentiation between populations (0 ) at eight loci was 2.93%, which corresponds to the statistical significance level. The most highly polymorphic loci proved to be the least differentiating among the samples analyzed. (Biologiya Morya, 2013, vol. 39, no. 4, pp. 272-280).
Keywords: sockeye salmon, microsatellite nuclear DNA, population genetic variations.
Нерка ОпсогЪупсЪт пегка (Ша1Ьаит) является одним из самых ценных промысловых видов тихоокеанских лососей, относится к проходным моноцикличным видам и имеет длительные пресноводный и морской периоды жизненного цикла (Смирнов, 1975; Коновалов, 1980; Бугаев, 1995). Наиболее крупные и экономически важные стада азиатской нерки воспроизводятся на Камчатке. В течение продолжительного периода времени камчатские популяции нерки подвергались интенсивному воздействию промысла, и их численность в бассейнах ряда нерестовых водоемов значительно сократилась. Стало очевидным, что для сохранения и поддержания стад нерки в оптимальном состоянии необходима точная информация об их популяционно-генетической структуре, которая должна являться основой для оптимального распределения промысловых нагрузок.
Ранее было показано, что нерка имеет сложно организованную внутривидовую структуру (Алтухов, 1983; Бугаев, 1995; Варнавская, 2006), обусловленную, пре-
жде всего, наличием инстинкта "хоминга" - возврата производителей к месту нереста их родителей (Hartman, Raleigh, 1966; Варнавский, Варнавская, 1985), который обеспечивает высокую репродуктивную изоляцию нерестовых группировок. В связи с большой пространственной подразделенностью нерестовых площадей, использованием производителями различных типов нерестилищ (ключевые, речные и озерные) и значительной продолжительностью нерестового хода (с конца мая по октябрь), у нерки наблюдается дифференциация на сезонные и экологические формы (Смирнов, 1975; Коновалов, 1980; Бугаев, 1995; Варнавская, 2006).
В последнее время в качестве информативных популяционно-генетических маркеров широко применяются микросателлитные последовательности ядерной ДНК, представляющие собой до сотни тандемных повторов коротких последовательностей, имеющих длину от 1 до 6 пар нуклеотидов (Tautz, 1989). Для выявления внутрипопуляционной подразделенности крупных стад
нерки на основе изменчивости микросателлитных локу-сов одними из первых были исследованы бассейны нерестовых водоемов Британской Колумбии - реки Насс и Скина, зал. Беркли (ВеасЬат й а1., 1998, 1999, 2000). Некоторые камчатские популяции вошли в состав базы данных (около 300 выборок нерки Азии и Северной Америки) по частотам 14 микросателлитных локусов, при анализе которой была показана выраженная дифференциация как региональных групп, так и локальных популяций внутри них (ВеасЬат й а1., 2005, 2006; Варнавская, 2006).
По шести микросателлитным локусам исследованы выборки нерки из крупнейших озерно-речных систем п-ва Камчатка (Хрусталева, 2007; Хрусталева и др., 2010). Точность индивидуальной идентификации нерки с применением микросателлитов оказалась существенно выше, чем при использовании сравнимого числа маркеров однонуклеотидного полиморфизма (БЫР) (Хрусталева и др., 2010).
Цель настоящей работы - расширение информации о популяционно-генетической структуре нерки п-ва Камчатка на основе данных по аллельной изменчивости микросателлитных локусов.
МАТЕРИАЛ И МЕТОДИКА
Материалом послужили 12 выборок производителей нерки, отобранных на восточном побережье Камчатки (588 экз.) (табл. 1). Сбор тканевых образцов (плавник или сердечная мышца) проводили на основных нерестилищах бассейна р. Камчатка, а также в устьях и бассейнах нерестовых рек Карагинского и Олюторского районов (рис. 1).
Таблица 1. Места сбора и объем материала для исследования изменчивости микросателлитных локусов в популяциях нерки восточного побережья Камчатки
№ Место взятия выборок Дата Объем выборки,
экз.
Оз. Азабачье (бассейн р. Камчатка)
1 Р. Бушуйка 14.08.2010 48
2 Р. Пономарка 30.06.2009 50
Бассейн р. Камчатка
3 Р. Киревна 24.07.2003 50
4 Оз. Двухъюрточное 13.07.2003 50
5 Р. Еловка 18.06.2010 50
6 Р. Камчатка (верховья) 01.07.2009 50
Карагинский район
7 Р. Ивашка 23.07.2010 50
8 Р. Хайлюля 07.07- 48
10.07.2010
Олюторский район
9 Р. Навыринваям 02.10. 2010 50
10 Р. Апука 26.05- 46
01.06.2010
11 Лагуна Анана 06.07.2010 48
12 Лагуна Северная 23.06.2010 48
Всего 588
Рис. 1. Карта-схема мест взятия выборок для исследования изменчивости микросателлитных локусов у нерки восточного побережья Камчатки. Цифры 1-12 соответствуют номеру выборок в табл. 1.
Тотальную ДНК выделяли стандартным способом с помощью метода протеиназного гидролиза в присутствии до-децилсульфата натрия с последующим высаливанием белков, удалением их вместе с клеточными обломками центрифугированием и осаждением ДНК из супернатанта изопропанолом (Маниатис и др., 1984; Sambrook et al., 1989).
Амплификацию проводили с использованием наборов, содержащих готовую лиофилизированную смесь для поли-меразной цепной реакции (ПЦР) - Gene Pak PCR Core (ООО "ИзоГен", Россия). В пробирки со смесью для ПЦР добавляли 10 мкл буфера, 5 мкл геномной ДНК и 5 мкл смеси специфичных праймеров. ПЦР микросателлитных локусов нерки проводили по ранее описанной для кеты Oncorhynchus keta схеме (Афанасьев и др., 2006): денатурация в течение 2 мин при 94°С, затем 8 циклов, включающих 1 мин денатурации ДНК-матрицы при температуре 94°С, 30 с отжига праймеров при Х°С (температура отжига для индивидуальной пары праймеров приведена в табл. 2) и 15 с элонгации при 72°С; далее следовал 21 цикл, включающий 30 с при температуре 94°С, 30 с при Х°С и 15 с при 72°С; завершающая элонгация - 3 мин при 72°С.
В настоящей работе с целью подбора полиморфных и достаточно объективно интерпретируемых микросателлитных маркеров были апробированы 29 локусов: Okila,b, ОЬ'6, (Smith et al., 1998), Otsl00, Otsl03, ОЫ07, ОЫ08 (Beacham et al., 1998; Nelson, Beacham, 1999), Ots2, Ots3 (Banks et al., 1999), Omyll (Morris et al., 1996), OtsG6%, OtsG%5 (Williamson et al., 2002), ОпеШ, 0ne\02, ОиеЮЗ, ОиеЮ4, ОиеЮ8,0пе\09, One 111, OneWA (Olsen et al., 2000), Оке 3 (Buchholz et al., 2001),
Таблица 2. Праймерные последовательности, использованные в анализе
Локус Источник информации T°C отжига Последовательность праймеров
ОЫ07 Nelson, Beacham etal., 1999 51.0 F -ACA-GAC-CAG-ACC-TCA-ACA R -ATA-GAG-ACC-TGA-ATC-GGT-A
Okil a, b Smith et al., 1998 57.5 F -AGG-ATG-GCA-GAG-CAC-CAC-T R - CAC-CAT-AAT-CAC-ATA-TTC-AGA
One 104 Olsen et al., 2000 53.0 F - GCT-ACT-ACA-ATC-CTA-GTC-TGT-GAT-T R - CAT-CTT-CTT-CAG-TGG-CTG-TAG-AT
One 109 Olsen et al., 2000 53.5 F -AGG-GAG-AGA-AGA-GAG-GGA-GA R - CCT-CAG-AAG-TAG-CAT-CAG-CTC
OtsG6% Williamson et al., 2002 48.0 F - TAT-GAA-CTG-CAG-CTT-GTT-ATG-TTA-GT R - GTT-TCA-TGT-CGG-CTG-CTC-AAT-GTA
OtsG%5 Williamson et al., 2002 49.0 F -AGC-ACT-GAC-TTA-ATA-TAC-ACA-CTG-A R - GCT-TAC-AAC-TCA-TTA-TTT-GGA-TGT-TG
Oki6 Smith et al., 1998 49.0 F - TCA-ACA-GAT-AGA-CAG-GTG-ACA-CA R-AAC-AGA-CAG-CTA-ATG-CAG-AAC-G
ОтуЗО! (Estoup, Angers, 1998), Оту 1011 (Spies et al., 2005), Ssa\97 (O'Reilly et al., 1996), Ssa20.\9 (Sanchez et al., 1996), Ogo2, OgoS, (Olsen et al., 1998), OmmlOlO (Rexroad et al., 2001), Оие8 (Scribner et al., 1996). Для дальнейшего анализа нерки были отобраны восемь полиморфных микросателлитов (табл. 2). Большинство из апробированных локусов оказались непригодными для анализа вследствие того, что при рекомендованных авторами условиях не был получен ПЦР-продукт или его размер не позволил с уверенностью интерпретировать полученные аллельные варианты.
Для двух пар локусов
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.