ГЕНЕТИКА, 2015, том 51, № 2, с. 200-216
ГЕНЕТИКА ЖИВОТНЫХ
УДК 575.17+575.13:597.442
ИЗМЕНЧИВОСТЬ МИТОХОНДРИАЛЬНОЙ ДНК, ИСТОРИЧЕСКАЯ ДЕМОГРАФИЯ И ПОПУЛЯЦИОННАЯ СТРУКТУРА АМУРСКОГО ОСЕТРА Acipenser schrenckii Brandt, 1869 © 2015 г. С. В. Шедько1, И. Л. Мирошниченко1, Г. А. Немкова1, В. Н. Кошелев2, М. Б. Шедько1
1Биолого-почвенный институт Дальневосточного отделения Российской академии наук, Владивосток 690022 e-mail: shedko@biosoil.ru 2Хабаровский филиал Тихоокеанского научно-исследовательскогорыбохозяйственного центра,
Хабаровск 680000 Поступила в редакцию 23.06.2014 г.
Исследована изменчивость контролирующего участка (D-петли) мтДНК у амурского осетра — эндемика р. Амур, находящегося в Красном списке МСОП (IUCN) в статусе вида с крайне высоким риском вымирания в природе (Critically Endangered). Секвенирование 796—812 пн D-петли у 112 осетров, собранных в Нижнем Амуре, выявило 73 различных гаплотипа. Выборка имела высокий уровень гаплотипического (0.976) и нуклеотидного (0.0194) разнообразия. Найденные гаплотипы распались на две хорошо выраженные монофилетические группировки — BG (n = 39) и SM (n = 34), различавшиеся (HKY-дистанция) в среднем по 3.41% нуклеотидных позиций при среднем внутри-групповом уровне отличий в 0.54 и 1.23%, соответственно. Гаплотипы SM-группы отличались, кроме того, наличием делеции размером 13—14 пн. Большинство образцов (66 из 112) несли BG-гапло-типы. Форма распределения попарных нуклеотидных различий, результаты тестов на нейтральность, на соответствие модели внезапной демографической экспансии или модели экспоненциального роста в совокупности указали на произошедший в прошлом существенный рост численности популяции амурского осетра, наиболее отчетливо проявившийся при рассмотрении данных по BG-гаплогруппе. Построенные байесовские контурные диаграммы (скайлайны) показали, что этот рост начался около 18—16 тыс. лет назад. В настоящее время эффективная численность сильно сократившейся из-за перелова популяции амурского осетра может быть равна или даже меньше той, что была до начала указанного роста — во время последнего ледникового максимума. Наличие в митохондриальном генном пуле амурского осетра двух гаплогрупп, их неодинаковая эволюционная динамика и, судя по ограниченным данным, неравная представленность в российской и китайской частях бассейна р. Амур указывают на возможное существование в прошлом как минимум двух отдельных его популяций.
DOI: 10.7868/S0016675815020125
Семейство Acipenseridae — древняя группа рыб, ведущая свое начало с мезозоя и до сих пор широко, хотя и мозаично, распространенная в водоемах Северного полушария [1]. Рыбы этого семейства играют важную роль в экосистемах, а также имеют большую промысловую и эстетическую ценность.
Амурский осетр Acipenser schrenckii Brandt, 1869 — один из семи видов осетров, распространенных в бассейне Тихого океана и составляющих особую монофилетическую группировку Acipenseridae — "тихоокеанскую" [2, 3]. Ареал амурского осетра ограничен бассейном р. Амур. Это крупная рыба, способная достигать почти трех метров длины и более полутора сотен килограммов веса [4]. По типу питания амурский осетр — бентофаг, потребляющий в основном личинок водных насекомых, моллюсков, а также (реже) мелких рыб [5]. Основная масса его особей нагу-
ливается в русле Амура и его основных притоках. Часть особей амурского осетра для нагула выходит в солоноватые воды Амурского лимана. Известны единичные находки в водах с морской соленостью [6]. Размножается исключительно в пресной воде — как правило, в самом русле р. Амур. Ранее был широко распространен по всему бассейну Амура — от Онона и Аргуни до Амурского лимана, но сейчас в заметных количествах встречается лишь в Нижнем Амуре (ниже впадения р. Уссури) [7].
Из-за своих ценных пищевых качеств амурский осетр издавна подвергался нещадному легальному и нелегальному промыслу, который привел к существенному падению его численности уже к середине прошлого века [5]. В российской части бассейна Амура с 1958 г. и до сих пор промышленный и спортивный лов амурского осетра находится под запретом. В китайской ча-
сти бассейна его добыча никогда не прекращалась, и во вторую половину прошлого века объемы его вылова, напротив, только выросли [8]. С 1986 г. амурский осетр включен в Красный список Международного Союза Охраны Природы (IUCN Red List of Threatened Animals) как вид, находящийся в уязвимом (vulnerable) состоянии. Из-за неуклонного снижения численности амурский осетр в 1996 г. получил статус вида, находящегося в опасности (Endangered), а в 2010 г. — статус вида с крайне высоким риском вымирания (Critically Endangered) [9].
В задачу настоящей работы входило исследование изменчивости контролирующего региона митохондриальной ДНК у амурского осетра из Нижнего Амура. В результате с помощью этого высокополиморфного маркера был получен своеобразный генетический "портрет" популяции A. schrenckii, составленный на основе анализа выборок из района, где этот вид до последнего времени был более или менее многочислен. Этот "портрет" будет полезен не только для закладки основ мониторинга генетического разнообразия амурского осетра, а также природоохранных мероприятий, но и как затравка для дальнейших исследований его популяционной структуры и эволюционной истории.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
Материал по амурскому осетру был собран в ходе научного контрольного лова, проведенного Хабаровским филиалом ТИНРО-центра в нижнем течении р. Амур (район г. Николаевск-на-Амуре, примерно 53°7' с.ш., 140°40' в.д.) в мае—июне 2009 г (n = 41), августе—сентябре 2009 г. (n = 43) и сентябре 2010 г. (n = 27). Кроме того, заспиртованный кусок плавника одного экземпляра амурского осетра, случайно пойманного в Ульбанском заливе Охотского моря (53°32' с.ш., 137°19' в.д.) в сентябре 2009 г., был получен от рыбаков. Образцы отбирались неинвазионным способом (срезался небольшой кусочек кожи по задней кромке грудного плавника, который затем помещался в 96%-ный спирт).
Длина тела (AC) у 112 исследованных осетров варьировала в пределах 32—182 см (115.8 ± 38.6) и имела двухвершинное распределение. У 33 особей длина тела была менее 100 см (61.7 ± 17.6, lim= 32—96), а у 79 особей — равна или больше этого порога (138.5 ± 15.4, lim = 100-182).
Кроме выборок, взятых из естественных условий, были также проанализированы 16 особей амурского осетра (12 сеголетков и 4 годовика), взятых на Анюйском рыборазводном заводе (Нанайский район Хабаровского края) в августе 2008 г. Ранее эти особи были использованы в исследовании структуры кариотипа амурского осетра [10].
Тотальная ДНК была выделена стандартным фенол-хлороформным способом с использованием протеиназы K. Полноразмерная последовательность контролирующего региона мтДНК (D-loop) была амплифицирована с помощью праймеров LproF и DL651 [11], специфичных к фланкирующим его генам транспортной РНК (тРНК-Рго и тРНК-Phe соответственно).
Амплификацию проводили на термоциклере Biometra Tprofessional ("Biometra", Германия) в 25 мкл реакционной смеси, включавшей 0.1—0.2 мкг тотальной ДНК, 2.5 мкл буфера (60 мМ трис-HCl, pH 8.5; 1.5 мМ MgCl2; 25 мМ KCl; 10 мМ 2-мер-каптоэтанола; 0.1% тритона X-100), 0.5 мкл суммы дезокситрифосфатов из 10 мМ раствора, по 2.5 мкл обоих праймеров ("Биоссет", Новосибирск) из их 2 мкМ растворов, 2 е.а. Taq-полиме-разы ("СибЭнзим", Новосибирск) и деионизиро-ванную воду.
Полимеразную цепную реакцию проводили по следующей схеме: начальная денатурация (94°C — 120 с), 30 циклов амплификации (94°C — 45 с, 52°C - 30 с, 72°C - 60 с) и достройка цепей (72°C -480 с). Продукты амплификации очищали переосаждением и секвенировали с помощью набора Big Dye Terminator версии 3.1 ("Applied Biosystems", США) при использовании праймеров DL651, AHR и SchF [11]. Продукты реакции разделяли на автоматическом анализаторе ABI Prizm 3130 ("Applied Biosystems", США/''Hitachi", Япония) на базе Биолого-почвенного института ДВО РАН (г. Владивосток). ABI-хроматограммы собирали в контиги с помощью программ из пакета Staden [12].
Множественное выравнивание полученных нуклеотидных последовательностей осуществлено с помощью программы MAFFT v. 6.859 [13] методом итерационного уточнения — FFT-NS-i.
Основные показатели, характеризующие изменчивость полученных последовательностей D-петли — наблюдаемое (h) число гаплотипов, число полиформных (сегрегирующих) нуклео-тидных позиций (S), общее число вариабельных позиций (Pl, S плюс индели), число синглтонов (si), гаплотипическое (H) и нуклеотидное (я, p-ди-станция) разнообразие, и другие - определены с помощью набора утилит FaBox v. 1.4 [14] и программы Arlequin v. 3.5.1.3 [15].
BIONJ-дерево строили с помощью программы PAUP 4.0b10 [16] при использовании модели нук-леотидных замещений HKY, учитывающей основные особенности эволюции D-петли — неодинаковые доли четырех типов нуклеотидов и разную скорость транзиций и трансверсий. В качестве внешней группы использовали последовательности контролирующего региона мтДНК близких видов осетров — белого A. transmontanus
(AB042837, AF184108 и X54348) и осетра Дабри A. dabryanus (AY510085), взятые из Genbank/NCBI.
Проверку селективной нейтральности наблюдаемого ДНК-полиморфизма осуществляли с помощью батареи тестов, рассматривающих различные аспекты этой изменчивости: теста Ювен-са—Воттерсена [17, 18], разработанного в рамках модели бесконечно большого числа аллелей, а также тестов, в основе которых лежит модель бесконечно большого числа сайтов — Таджимы [19], H-теста Фей и Ву [20], ft-теста Фу [21] и теста Келли [22].
Тест Ювенса—Воттерсена выполнен в программе Arlequin, остальные — в программе DnaSAM [23]. В последнем случае нулевое распределение статистик генерировалось методом Монте-Карло в 10000 псевдослучайных симуляциях процесса коалесценции.
Поскольку в процессе исследования выяснилось, что обнаруженные у амурского осетра варианты D-петли формируют две четко очерченные группы гаплотипов (BG- и SM-гаплогруппы — см. ниже), то в дополнение к анализу суммарных данных нами также проводилось рассмотрение каждой из этих гаплогрупп по отдел
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.