ОНТОГЕНЕЗ, 2004, том 35, № 1, с. 16-22
= БИОЛОГИЯ РАЗВИТИЯ РАСТЕНИЙ =
УДК 575.16.575.21.581.19.581.466
ИЗМЕНЧИВОСТЬ СОДЕРЖАНИЯ ФЛАВОНОЛОВ ВО ФЛОРАЛЬНОМ
__w -t
МОРФОГЕНЕЗЕ РАСТЕНИИ МАКА Papaver somniferum L.1
© 2004 г. Р. Г. Беляева, Л. И. Евдокимова*
Институт биологии развития им. Н.К. Кольцова РАН 119991 Москва, ГСП-1, ул. Вавилова, д. 26 *Институт общей генетики им. НИИ. Вавилова РАН 117809 Москва, ул. Губкина, д. 3 Поступила в редакцию 11.02.03 г.
Окончательный вариант получен 15.07.03 г.
Изучали содержание флавонолов (кемпферола, кверцетина) в меристеме вегетативного и генеративного апексов главного побега растений в линиях флоральных мутантов мака Papaver somniferum L., а также на последовательных стадиях развития цветка в линии с нормальной структурой. Для изучения выделили пять стадий в развитии цветка. Показано, что флавонолы (кемпферол, кверцетин) присутствуют на всех изученных стадиях флорального морфогенеза во всех органах цветка. Однако содержание и распределение их в отдельных органах и на разных стадиях развития цветка резко различаются. Не выявлено значимых различий по содержанию флавонолов в меристемах вегетативного и генеративного апексов главного побега в линиях флоральных мутантов, а также между линиями, различающимися по количеству формируемых вегетативных фитомеров. Показано, что у растений с нормальной структурой цветка с началом дифференцировки органов цветка, т.е. с третьей стадии развития, содержание флавонолов (кемпферол + кверцетин) резко возрастает, достигая максимальной величины в открытом цветке, когда завершается гаметогенез и происходит оплодотворение. При этом уровень содержания флавонолов в лепестках (верхняя часть) и тычинках на всех стадиях развития максимален, тогда как в гинецее - минимален. Соотношение содержания флавонолов кемпферол : кверцетин на последовательных стадиях развития цветка сдвигается в сторону кверцетина. Очень существенно это соотношение изменяется в тычинках. Полученные данные позволяют обсуждать участие флавонолов в регуляции процессов флорального морфогенеза на стадиях дифференцировки и функционирования органов цветка.
Ключевые слова: генетическая регуляция развития растений, гомеозисные мутации цветка, экспрессия генов, флавонолы, морфогены.
Растения относятся к организмам с ярко выраженным регуляторным типом онтогенеза. В настоящее время открыты многие ключевые гены, ответственные за процесс развития растений (Хавкин, 1998; Ежова, 1999; Ежова, Склярова, 2001). Показано, что большинство морфогенети-ческих генов являются регуляторными, изменяющими характер экспрессии структурных генов (Doebley et al., 1998; Theissen et al., 2000). Для определения направления дифференцировки клетки у растений важными являются межклеточные взаимодействия и влияние внешнего градиента различных факторов, таких как приток фитогормо-нов (Hake, Char, 1997; Galweiler et al., 1998; Sessions et al., 2000). Для некоторых ключевых гормонов уже изучены пути передачи сигнала (Kende, Ze-evaart, 1997; Peng et al., 1999). Открыты новые морфогены, обладающие сигнальной функцией в регуляции экспрессии генов дифференцировки
1 Работа поддержана Российским фондом фундаментальных исследований (проект < 01-04-48586).
(Clouse, 1996). Известно, что в тканях всех органов растений обнаружены физиологически активные фенольные соединения (Харборн, 1968; Запрометов, 1993, 1996). В цветках наиболее интенсивно идет биосинтез флавоноидов. Являются ли флавоноиды морфогенами, участвующими в регуляции процессов флорального морфогенеза и дифференцировки? В исследованиях на трансгенных растениях табака, кукурузы, петунии было показано, что флавонолы выполняют роль сигнальных веществ в процессах прорастания пыльцы и роста пыльцевой трубки (Mo et al., 1992; Pollak et al., 1995; Ylstra et al., 1994). У Petunia hybrida L. впервые получен индуцированный мутант white anther (wha), самостерильный, с измененной окраской венчика и пыльников, у которого блокирован биосинтез кемпферола в пыльниках в результате мутации гена ChsA, контролирующего активность халконсинтазы -фермента начального этапа биосинтеза флавоноидов (Napoli et al., 1999). Мы проводим изучение
динамики накопления флавонолов в отдельных органах цветка на последовательных стадиях его развития в линиях флоральных мутантов. Эти исследования основаны на использовании генетической коллекции флоральных мутаций у мака Pa-paver somniferum L. (Беляева, 1988, 1995, 1997).
В настоящей работе изучали содержание флавонолов (кемпферол, кверцетин) в меристеме вегетативного и генеративного апексов главного побега растений в линиях флоральных мутантов мака и в отдельных органах цветка на последовательных стадиях его развития в линии с нормальной структурой цветка.
МАТЕРИАЛ И МЕТОДИКА
Растения мака Papaver somniferum L. имеют ряд необходимых для исследования преимуществ. Эти растения с детерминированным ростом и мо-нокарпическим побегом имеют достаточно большие меристемы вегетативного и генеративного апексов главного побега, крупные цветки с большим количеством элементов органов цветка, что очень важно при изучении динамики количественных изменений в биосинтезе флавонолов. В работе использовали следующие линии флоральных мутантов: 59, пыльник в лепестке Ant; 3/73, махровость msp pl2; 24, лепесток-чашелистик ptsp; двойной мутант (24 х 3/73) ptsp msp pl2 (Беляева, 1988, 1995, 1997, 1999). Для изучения динамики содержания флавонолов в линии 54 с нормальной структурой цветка выделили пять стадий развития цветка:
1) бутон, чашелистики закрыты, сформированы примордии лепестков и тычинок;
2) бутон, идентифицированы примордии всех органов цветка, гинецей состоит из отдельных примордиев плодолистиков без рылец;
3) бутон, начало дифференцировки органов цветка, в лепестках развита только область пятна без пигмента, пыльники на очень коротких тычиночных нитях, гинецей сформирован уже как коробочка, закрытая сросшимися рыльцами плодолистиков, цветонос только начинает развиваться;
4) бутон, цветонос полностью развит, но изогнут вниз цветком, все органы цветка интенсивно растут, появляется первичная окраска лепестков, стадия спорогенеза и начала гаметогенеза;
5) бутон или раскрытый цветок, цветонос прямой, пыльники пылят, рыльце созрело, завершается гаметогенез, оплодотворение.
Изучали динамику содержания флавонолов кемпферола и кверцетина. Апикальные меристемы выделяли под микроскопом МБС-6. Выделенные меристемы, цветки, органы цветка взвешивали и фиксировали смесью этанола и концентрированной соляной кислоты (97 : 3 по объему) из расчета 10 мл смеси на 1 г материала. Экстрагировали флавонолы в темноте при 0-4°С. Для извлечения флавонолов из фиксированной смеси после гидролиза 4 N соляной кислотой на кипящей водяной бане в течение 15 мин использовали диэтиловый эфир. Разделение флавонолов проводили в восходящем токе трех систем растворителей: а) Forestal - ледяная уксусная кислота, концентрированная соляная кислота, вода (30 : 3 : 10 по объему); б) CAW - хлороформ, уксусная кислота, вода (10 : 9 : 1); в) хлороформ, этилацетат, муравьиная кислота (5 : 4 : 1). Идентификацию флавонолов проводили методом хроматографии
Таблица 1. Продолжительность вегетативного и генеративного развития главного побега растений Papaver somniferum L. в линиях флоральных мутантов, различающихся по количеству вегетативных фитомеров*
Генеративное развитие, сут
Линия, мутация Число вегетативных фитомеров Период вегетативного развития, сут формирование примордиев, органов цветка, спорогенез гаметогенез, оплодотворение Период от посева до раскрытия цветка, сут
54, норма 23-25 42-45 27-30 6-7 75-82
59, пыльник в лепестке 15-17 34-36 23-26 6-7 63-69
3/73, махровость 23-25 42-45 27-31 6-7 75-83
24, лепесток-чашелистик 21-23 40-42 26-29 6-7 72-78
24 х 3/73, двойной мутант 21-23 40-42 29-31 6-7 75-80
* Наблюдения за 2001 г. 2 ОНТОГЕНЕЗ том 35 < 1 2004
Таблица 2. Содержание флавонолов в апикальной меристеме главного побега растений Papaver somniferum L. в линиях флоральных мутантов, у.е. на 1 г сырого веса
Меристема апекса
Линии вегетативного генеративного
кемпферол кверцетин кемп-ферол квер-цетин
54 2.3 - 1.5 -
59 2.6 - 2.0 1.0
3/73 1.2 - 1.7 -
24 2.9 - 0.5 -
24 х 3/73 0.8 - 0.8 -
на пластинах "Силуфол" на алюминиевой подкладке (Харборн, 1986). Относительное содержание флавонолов оценивали визуально по семи-бальной шкале. Конечные результаты количества флавонолов выражали в условных единицах (у.е.) на 1 г сырого веса. Флавонолы идентифицировали, сравнивая значения Rf исследуемых веществ и стандартных препаратов, просматривали в ультрафиолетовом свете после обработки парами аммиака. В некоторых случаях проводили повторную хроматографию. Определение флавонолов по каждому варианту проводили в трехкратной повторности. Отклонения от среднего значения из трех повторений (ошибка определения) не превышали 3 а.
РЕЗУЛЬТАТЫ
Мак относится к растениям с детерминированным типом развития, у которых время зацветания, переход от вегетативного к генеративному развитию задается числом уже сформированных
80-
Рис. 1. Динамика биосинтеза флавонолов (по оси ординат, у.е. на 1 г сырого веса) на последовательных стадиях развития цветка (по оси абсцисс) у растений Papaver somniferum L. в линии с нормальной структурой цветка.
1 - кемпферол, 2 - кверцетин, 3 - их сумма.
вегетативных фитомеров. В результате развивается монокарпический побег с терминальным цветком. Следовательно, экспрессия генов, контролирующих количество вегетативных фитомеров главного побега, является регулирующим фактором, позволяющим растению распознавать сигналы, через которые осуществляется переход с вегетативного морфогенеза на генеративный.
Мутантные линии, включенные в изучение, имеют генетически детерминированные различия по числу формируемых вегетативных фитомеров главного побега (Беляева, 1983). В скороспелой линии 59 с мутацией пыльник в лепестке Ant формируется 15-17 фитомеров. В других линиях переход на генеративное развитие происходит на 7-10 сут позже, после формирования 21-23 и 23-25 вегетативных фитоме
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.