НЕЙРОХИМИЯ, 2012, том 29, № 2, с. 122-127
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫЕ РАБОТЫ
УДК 612:822.3
ИЗМЕНЕНИЕ АКТИВНОСТИ КАСПАЗЫ-3 В ПЕРЕЖИВАЮЩИХ СРЕЗАХ ГИППОКАМПА ЗАВИСИТ ОТ ДЛИТЕЛЬНОСТИ СОХРАНЕНИЯ СИНАПТИЧЕСКОЙ ПОТЕНЦИАЦИИ © 2012 г. И. В. Кудряшова*, М. В. Онуфриев, Н. В. Гуляева
Учреждение Российской академии наук Институт высшей нервной деятельности и нейрофизиологии РАН, Москва
Исследовали изменение активности протеолитических ферментов в фазе стабилизации синаптиче-ских модификаций после индукции долговременной пластичности в поле СА1 переживающих срезов гиппокампа крыс Вистар. Тестирование электрофизиологических показателей производили в течение 1 ч после высокочастотного (100 Гц, 1 с) раздражения коллатералей Шаффера (ВЧР). В контрольных срезах тех же животных применяли стандартный протокол тестирования, но не использовали никаких воздействий, индуцирующих долговременную пластичность. Через 1 ч после индукции LTP срезы замораживали и затем в каждом отдельном срезе определяли активность каспазы-3 или калпаина. Было обнаружено, что через 1 ч после ВЧР активность каспазы-3 достоверно меньше, чем в контрольных срезах. К этому сроку в части срезов происходила депотенциация, и процент восстановления фокального ВПСП достоверно коррелировал с активностью каспазы-3. Достоверное снижение активности этого фермента наблюдалось именно в тех срезах, которые восстанавливали свою активность. Предполагается, что снижение активности каспазы-3 после ВЧР может объясняться ослаблением нейродегенеративных процессов под действием афферентного притока. Срезы, сохранившие остаточную потенциацию, подвергались такой же афферентной активации, но активность каспазы-3 в этой группе срезов была достоверно выше. Это, по-видимому, свидетельствует о повторной активации каспазы-3 при развитии долговременных перестроек. Если исключить влияние синаптической потенциации, связь между активностью каспазы-3 и приростом амплитуды популяционного спайка в фазе поддержания LTP практически отсутствует. В большинстве срезов синаптическая потенциация сопровождалась некоторым снижением амплитуды пресинап-тического компонента, эти изменения развивались независимо от синаптической потенциации. Признаков влияния калпаина на те же показатели мы не обнаружили. Полученные результаты подтверждают специфичность функционального значения протеолитических ферментов в механизмах синаптической потенциации.
Ключевые слова: переживающие срезы гиппокампа, фокальный ВПСП, популяционный спайк, пресинап-тический компонент, долговременная потенциация, каспаза-3, калпаин.
Использование ингибиторов протеолитических ферментов в экспериментах in vivo и in vitro подтверждает их участие в нормальной нейропла-стичности [1—5]. Эти эксперименты, однако, не позволяют выявить условия и конкретные сроки вовлечения того или иного фермента в развитие долговременных перестроек.
В проведенных ранее экспериментах на переживающих срезах гиппокампа крыс Вистар мы измеряли активность каспазы-3 сразу после высокочастотного раздражения коллатералей Шаффера. После этой процедуры активность каспазы-3 была достоверно выше, если сравнивать с контрольными срезами, имеющими стандартные характеристики. Необходимо, однако, отметить, что и в срезах гиппокампа, не подвергавшихся высокочастотной стимуляции, активность этого фермента
* Адресат для корреспонденции, 117485, Москва, ул. Бутлерова 5а, e-mail: iv_kudryashova@mail.ru.
могла быть при определенных условиях в такой же степени повышена. В частности это наблюдалось в тех срезах, в которых тестирование парными стимулами сопровождалось необычайно большим приростом амплитуды второго ответа (парная фа-силитация, РРБ) [6]. В группе срезов, обладающих такими свойствами, высокочастотная стимуляция коллатералей Шаффера не приводила к дополнительной активации каспазы-3. К сожалению, извлечение срезов сразу после тетанизации исключает возможность определения зависимости свойств длительной потенциации от уровня активности ферментов.
В данной работе исследовали изменение активности протеолитических ферментов в фазе стабилизации синаптических модификаций после индукции долговременной пластичности в поле СА1 переживающих срезов гиппокампа крыс Вистар. Предполагалось, что на каком бы этапе не происходила активация ферментов, поддерживающих
развитие LTP, остаточные или следовые эффекты могут быть выявлены и в более поздние сроки.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
Электрофизиологические эксперименты проводили на переживающих срезах гиппокампа крыс Вистар массой 90—180 г. Состав перфузионной среды (мМ): NaCl 124; KCl 5; MgSO4 • 7H2O 1.3; CaCl2 2.5; NaH2PO4 1; NaHCO3 26; D-глюкоза - 10; карбоген — 95% O2 и 5% CO2; pH 7.3-7.4, температура 34.3°С. Для регистрации фокальных потенциалов в пирамидном слое поля СА1 использовали стеклянные микроэлектроды, заполненные 0.33 M раствором хлористого натрия. Раздражающие биполярные электроды устанавливали в радиальном слое на коллатерали Шаффера. Помимо амплитуды популяционного спайка измеряли наклон фокального ВПСП и амплитуду пресинаптического компонента. Для индукции LTP применяли высокочастотное раздражение коллатералей Шаффера (1 с, 100 Гц). До и в течение 1 ч после тетанизации тестирование электрофизиологических показателей производили с интервалом 30 с. В контрольных срезах тех же животных применяли стандартный протокол тестирования, но не использовали никаких воздействий, индуцирующих долговременную пластичность.
Сразу после тестирования срезы замораживали при температуре —70°С. Активность каспазы-3 или калпаина определяли в каждом отдельном срезе флюориметрическим методом. Для определения активности фермента пробы инкубировали 60 мин при 37°С в реакционном буфере, содержащем 150 мМ HEPES, pH 7.4, 15% сахарозу, 15 мМ дитиотрейтол, 0.15% CHAPS (все — Sigma, США), 1 мМ ЭДТА, в двух параллельных образцах, один из которых содержал 50 мкМ N-ацетил-Асп-Глу-Вал-Асп-7-амино-4-трифторметилкумарин (Ac-DEVD-AMC, флюорогенный субстрат каспазы-3, Biomol, США), а другой 50 мкМ N-ацетил-Асп-Глу-Вал-Асп-7-амино-4-метилкумарин и 5 мкМ N-ацетил-Асп-Глу-Вал-Асп-СНО (Ac-DEVD-CHO, конкурентный ингибитор каспазы-3, Biomol, США), конечная концентрация белка составляла 0.5 мг/мл. Флюоресценцию регистрировали при длинах волн возбуждения и эмиссии 400 и 490 нм соответственно на спектрофлюориметре Hitachi F-3000, оборудованном микрокюветой. Активность каспазы-3 рассчитывали по разности скоростей накопления свободного 7-амино-4-метилкумарина в пробах, содержащих и не содержащих специфический ингибитор каспазы-3, и выражали в пмоль/мин/мг белка. В качестве флюоресцентного стандарта использовали 7-амино-4-метилкумарин (Sigma, США). Определение активности калпаина проводили флюориметрическим методом с использованием синтетического субстрата suc-LLVY-AMC ^-сукцинил-Лей-Лей-Вал-Тир-7-амино-4-ме-
тилкумарин). Для определения активности калпа-ина пробы инкубировали 60 мин при 37°С в реакционном буфере, содержащем 20 мМ трис/HCl, рН 7.4, 5 мМ CaCl2, 1 мМ ДТТ, 50 мкМ suc-LLVY-AMC, конечная концентрация белка составляла 0.5 мг/мл. Для определения специфичности расщепления субстрата Са2+-зависимым калпаином в параллельный образец вносили все компоненты, кроме 5 мМ CaCl2 и по 10 мМ ЭДТА и ЭГТА. Флюоресценцию образовавшегося АМС регистрировали, как описано выше. Активность калпаина рассчитывали по разнице скоростей расщепления suc-LLVY-AMC в образцах в присутствии Са2+ или хелаторов Са2+.
Для определения достоверности межгрупповых различий использовали i-критерий Стьюдента. Для оценки статистической связи электрофизиологических показателей с активностью протеоли-тических ферментов использовали корреляционный анализ.
РЕЗУЛЬТАТЫ
Активность каспазы-3 определяли в каждом отдельном срезе флюориметрическим методом. Необходимо отметить, что результаты измерения активности этого фермента в наших экспериментах (от 1.7 до 3.16 пмоль/мин/мг, в среднем 2.28 ± ± 0.17 пмоль/мин/мг в контрольных срезах гиппокампа) находятся в соответствии с данными, полученными как в нашей лаборатории [3], так и другими авторами [7—9] на интактных, здоровых животных. Этот факт не дает основания полагать, что активация каспазы-3 происходит в процессе приготовления срезов.
Было обнаружено, что через 1 ч после высокочастотного раздражения коллатералей Шаффера активность каспазы-3 достоверно меньше, чем в контрольных срезах (в среднем 1.86 ± 0.11, р < 0.05, рис. 1а). При используемых параметрах тетаниза-ции синаптическая потенциация заканчивалась в разные сроки и через час после индукции в части срезов обнаружено частичное или полное восстановление амплитуды ответов до контрольного уровня, причем процент восстановления амплитуды популяционного ВПСП достоверно коррелировал с активностью каспазы-3 (г = 0.64, р < 0.03, рис. 1б). Достоверное снижение активности этого фермента наблюдалось именно в тех срезах, которые восстанавливали свою активность (р < 0.05). В остальных срезах остаточная потенциация составляла 116—229%. В срезах этой подгруппы по сравнению с контрольными срезами достоверного снижения активности каспазы-3 выявить не удалось (р = 0.23). Что еще более существенно, достоверные межгрупповые различия были обнаружены при сравнении активности каспазы-3 в срезах сохранивших и не сохранивших остаточную потен-
300 Г
Рч
g 250
о
200 -
С 150
и с
® 100
2.5
50 -
я
и
л
ч о
3
2.0
1.5
л
т се С
£ 1.0
Л
м
£ о О
я
<ч
и
н
0.5
p < 0.02
1.0 1.2 1.4 1.6 1.8 2.0 2.2 2.4 2.6 Активность каспазы-3, пмоль/мин/мг
Рис. 1. Свойства LTP в фазе поддержания зависят от активации каспазы-3. а: средняя (±SE) активность каспазы-3 в контроле и через 1 ч после высокочастотного раздражения коллатералей Шаффера (черный столбик). Контрольные срезы тех же животных представлены двумя группами. В пассивном контроле (белый столбик) срезы не подвергались электрической стимуляции. В другой контрольной группе (серый столбик) применяли стандартный протокол тестирования, но не использовали никаких воздействий, индуцирующих долговременную пластичность. б: линейная регрессия остаточных модификаций ¡ВПСП и активности кас
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.