научная статья по теме ИЗМЕНЕНИЕ АКТИВНОСТИ ПЕРОКСИДАЗЫ ПРИ ПАТОГЕНЕЗЕ КОЛЬЦЕВОЙ ГНИЛИ КАРТОФЕЛЯ Биология

Текст научной статьи на тему «ИЗМЕНЕНИЕ АКТИВНОСТИ ПЕРОКСИДАЗЫ ПРИ ПАТОГЕНЕЗЕ КОЛЬЦЕВОЙ ГНИЛИ КАРТОФЕЛЯ»

ФИЗИОЛОГИЯ РАСТЕНИЙ, 2004, том 51, № 4, с. 529-533

УДК 581.1

ИЗМЕНЕНИЕ АКТИВНОСТИ ПЕРОКСИДАЗЫ ПРИ ПАТОГЕНЕЗЕ

КОЛЬЦЕВОЙ ГНИЛИ КАРТОФЕЛЯ

© 2004 г. И. А. Граскова, А. С. Романенко, С. В. Владимирова, А. В. Колесниченко

Сибирский институт физиологии и биохимии растений Сибирского отделения Российской академии наук, Иркутск Поступила в редакцию 21.08.2002 г.

Изучали влияние вирулентного штамма 5369 возбудителя кольцевой гнили картофеля Clavibacter michiganensis subsp. sepedonicus на активность пероксидазы в различных тканях растений картофеля, выращенных в стерильных условиях. Показано, что при корневом заражении растения активность фермента возрастала в клетках всех типов тканей (корни, листья, стебли). В клетках картофеля устойчивого к патогену сорта Луговской эта активность была значительно выше, чем в клетках восприимчивого сорта Лукьяновский. При совместном культивировании суспензионных культур клеток данных сортов картофеля с бактериальным патогеном также наблюдали увеличение активности пероксидазы в клетках устойчивого сорта, а в клетках восприимчивого сорта - повышение активности было значительно меньшим. Показано, что при обработке клеток суспензионных культур картофеля экзополисахаридами, выделяемыми штаммом 5369 активность внутриклеточных и внеклеточных пероксидаз повышалась и степень этого повышения зависела от сорта картофеля.

Solanum tuberosum - Clavibacter michiganensis subsp. sepedonicus - патогенез - пероксидаза

Взаимодействие патогена и растения-хозяина вызывает значительные изменения в метаболизме клеток, что, прежде всего, отражается на активности многих ферментов, в том числе и пероксидазы [1]. Пероксидаза является одним из распространенных ферментных белков, обладающим широким спектром действия. Она участвует в окислении субстратов, в процессах лигнификации клеточных стенок, в процессах фотосинтеза, в дыхании и регулировании процессов роста. В ряде работ показано увеличение активности пероксидазы при патогенезе [1-3]. Поэтому пероксидазу рассматривают как одну из важнейших каталитических систем среди биохимических факторов защиты растений от патогенных микроорганизмов, активно участвующую в саморегуляции метаболизма растений при заражении [1, 2].

Известно, что Clavibacter michiganensis subsp. sepedonicus (Cms) вызывает кольцевую гниль клубней и завядание надземной части растений картофеля [4]. Показано, что при инфицировании вирулентным штаммом 5369 Cms клеток различных сортов картофеля, выращенных в сте-

Сокращения: Cms - Clavibacter michiganensis subsp. sepedonicus, ЭПС - экзополисахариды.

Адрес для корреспонденции: Граскова Ирина Алексеевна. 664033 Иркутск, а/я 1243. Факс: (3952) 51-07-54; электронная почта: graskova@sifibr.irk.ru

рильных условиях, происходит увеличение активности пероксидазы растения-хозяина [5].

Simons с соавт. [6] было показано, что заражение нижних листьев растений табака вирусом табачной мозаики приводит к повышению активности пероксидазы в листьях, расположенных выше инокулированных. Наиболее чувствительной к воздействию фитопатогенов, как было установлено впоследствии, являются растворимые пероксидазы, слабо связанные с клеточными стенками [7]. Поскольку образование активных форм кислорода, в том числе перекиси водорода, в настоящее время считается одним из основных механизмов развития фитоиммунитета и системной устойчивости, то изменение активности растворимых пероксидаз может, вероятно, служить свидетельством развития системной устойчивости растения [8].

Целью настоящей работы явилось выяснение того, изменяется ли активность пероксидазы в листьях растений картофеля при заражении корней вирулентным штаммом 5369 Cms. Для этого было необходимо изучить: 1) изменение активности фермента в тканях разных органов растений при инфицировании кольцевой гнилью корней растений; 2) влияние экзополисахаридов, вырабатываемых этими бактериями, на активность пе-роксидазы.

МЕТОДИКА

Растительный материал. В работе были использованы сорта картофеля (Solanum tuberosum L.) Лу-говской (устойчивый к патогену) и Лукьяновский (восприимчивый к патогену). Пробирочные растения выращивали из черенков на агаризирован-ной MC-среде с добавлением 10 г/л сахарозы ("Ре-ахим", Россия), 1.0 мг/л тиамина, 0.5 мг/л пири-доксина, 0.3 мг/л 8-оксихинолина, 0.1 мг/л ИУК ("Sigma", США), 1.0 мг мг/л аскорбиновой кислоты и 0.02 мг/л феруловой кислоты ("Serva", Германия) [9]. Через 10 сут растения пересаживали в аналогичную среду, но без агара и еще через 6 сут использовали для культивирования с бактериальным патогеном.

Суспензионные культуры клеток получали из каллусов, выращенных из листовых тканей тех же сортов картофеля. Для этого в 100 мл жидкой питательной MC-среды с добавлением гормонов и витаминов [9] помещали 2-5 мг каллусной ткани и встряхивали на качалке до получения суспензионных культур.

Бактериальный материал. Использовали вирулентный штамм 5369 Clavibacter michiganensis subsp. sepedonicus (Spieck. et Kotth.) Skapt et Burkh который был получен из НИИ картофельного хозяйства (пос. Коренево, Московская обл.). Бактерии культивировали на картофельном агаре с 1.5%-ной глюкозой 5-6 сут. Затем их культивировали стационарно 3 сут при 25°С на жидкой питательной среде, содержащей 5.0% дрожжевого экстракта ("Sigma"), 1.5% глюкозы, 0.5% СаС03 ("Реахим").

Культивирование растений с бактериями. В жидкую среду, на которой росли пробирочные растения картофеля, добавляли 1 мл свежеприготовленной бактериальной суспензии (2 х 108 клеток/мл) и культивировали 30 сут. Затем ткани корней, листьев и стеблей использовали для определения активности пероксидазы.

Культивирование суспензионных культур картофеля с бактериями. В колбу помещали 90 мл 7-дневной суспензии клеток (500 клеток/мл) картофеля, добавляли 10 мл бактериальной суспензии (2 х 104 клеток/мл) и культивировали 24 ч при 25°С, затем определяли активность фермента во вне- и внутриклеточных фракциях.

Определение пероксидазной активности. Пе-роксидазную активность анализировали в корнях, листьях и стеблях контрольных и инфицированных растений картофеля, а также в инфицированных и неинфицированных клетках суспензионной культуры. Из растений, выращенных в стерильных условиях, брали навески тканей листьев, корней, стеблей по 450 мг, растирали в 10 мл 0.1 М цит-ратно-фосфатного буфера рН 6.2 в присутствии Поликлара АТ для связывания фенолов. Гомоге-нат центрифугировали при 3000 g в течение

15 мин и супернатант использовали для определения активности фермента. Для экстракции внеклеточных пероксидаз навески по 450 мг суспензионных тканей картофеля помещали в шприц, заливали 4 мл холодного цитратно-фосфатного буфера (0.1 М, рН 6.2) и дважды выдерживали под вакуумом по 1 мин. Суспензию фильтровали и в фильтрате определяли пероксидазную активность. Для выделения внутриклеточных пероксидаз неэкстрагированный материал растирали в 2 мл 0.1 М цитратно-фосфатного буфера, рН 6.2. Полученный гомогенат центрифугировали 15 мин при 3000 g, и в супернатанте определяли активность фермента. Для этого измеряли увеличение оптической плотности при 580 нм в реакционной смеси из 0.5 мл 0.1 М цитратно-фосфатного буфера (рН 6.2), 0.5 мл 0.3% Н202 и 0.5 мл 0.05% гваякола ("Sigma"). Активность пероксидазы определяли при 25°С сразу после выделения и расчитывали по методу Бояркина [10]. Количество белка определяли по методу Lowry с соавт. [11].

Выделение и очистка экзополисахаридов. Вирулентный штамм 5369 бактерии Cms выращивали в колбах при 25°С в стационарных условиях на среде из 10 г/л дрожжевого экстракта ("Sigma") и 15 г/л глюкозы ("Реахим") в течение трех недель. Экзополисахариды (ЭПС), продуцируемые бактерией, выделяли и очищали по методу [12]. Бактериальные клетки удаляли из культуральной жидкости центрифугированием 30 мин при 20000 g. Надосадочную жидкость последовательно пропускали через колонки с ионообменными смолами Dowex-50 и затем Dowex-1 ("Sigma"). Элюат концентрировали на роторном испарителе под вакуумом до объема 100-150 мл, к которому затем добавляли в 6 раз большие объемы охлажденного ацетона и выдерживали 30 сут при -20°С. После осаждения ЭПС ацетон сливали, осадок высушивали и хранили при 4°С [12].

Обработка суспензионных клеток картофеля экзополисахаридами. В колбу помещали 90 мл 7-дневной суспензии клеток (500 клеток/мл) картофеля, добавляли ЭПС в конечной концентрации 0.1% и культивировали 24 ч при 25°С. Затем определяли активность фермента во вне- и внутриклеточных фракциях пероксидазы.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

После заражения растений устойчивого сорта картофеля, выращенных в стерильных условиях, вирулентным штаммом 5369 Cms активность пероксидазы в тканях листьев, стеблей и корней инфицированных растений резко возрастала (рис. 1а). Важно заметить, что инфицирование растений через корни приводило к увеличению активности фермента в листьях и стеблях, которые не контактировали с патогеном. Следовательно, при корневом инфицировании растений происходит

л

Я 3

(а)

(б)

4.5

св M

4 О VO h js

t^ 4 0

* 3 5

5 3.0

л

Ц 2.5 ¡2.0 1.5

о

Ц0.5

к я

g о

м <

_

- ^—-I

- / 4 I

—Ï- —ь- 1 -1

1 1 1 1 -ï— 1 1 3 1 1 1 1 1

4 6 8 10 12 14 16 18 20 22 24 Время после инокуляции, ч

Корни

Листья

Стебли

Рис. 2. Влияние штамма 5369 C. michiganensis subsp. sepedonicus на пероксидазную активность суспензионных клеток картофеля.

1 - сорт Луговской, контроль; 2 - сорт Луговской, в присутствии патогена; 3 - сорт Лукьяновский, контроль; 4 - сорт Лукьяновский, в присутствии патогена.

4

3

2

1

1

0

5

4

2

1

1

0

Рис. 1. Активность пероксидазы в тканях корней, листьев и стеблей картофеля в присутствии возбудителя кольцевой гнили картофеля.

а - сорт Луговской; б - сорт Лукьяновский. 1 - без патогена (контроль); 2 - в присутствии бактерии, штамм 5369.

активация пероксидазы в других органах: в листьях и в стебле. Поэтому можно сделать предположение об участии пероксидазы в развитии системной устойчивости растений картофеля сорта Луговской при заражении Cms. Это предположение согласуется с существующими представлениями о том, что пероксидазу можно

Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.

Показать целиком