МИКРОБИОЛОГИЯ, 2014, том 83, № 3, с. 284-294
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫЕ СТАТЬИ
УДК 579.242:579.841.3
ИЗМЕНЕНИЕ ДИССОЦИАТИВНОГО СПЕКТРА ПОПУЛЯЦИЙ МОЛОЧНОКИСЛЫХ БАКТЕРИЙ ПРИ ВОЗДЕЙСТВИИ АНТИБИОТИКОВ
© 2014 г. Н. Г. Лойко*, М. А. Краснова**, Т. В. Пичугина**, А. И. Гриневич**, В. И. Ганина**, А. Н. Козлова*, Ю. А. Николаев*, В. Ф. Гальченко*, Г. И. Эль-Регистан*
*Институт микробиологии им. С.Н. Виноградского Российской академии наук, Москва **Московский государственный университет пищевых производств Поступила в редакцию 10.10.2013 г.
Исследовано влияние антибиотиков канамицина и ампициллина на рост и диссоциативную активность популяций четырех штаммов молочнокислых бактерий: Lactobacillus sp. М76АТ, L. casei МБ, Enterococcus faecium М и E. faecium М3185. Показано, что присутствие антибиотиков в среде роста не только дозозависимо снижает количество жизнеспособных клеток, но и приводит к частичному или полному замещению доминантного по колониально-морфологическим признакам S-диссоцианта минорными вариантами Sm- и Sb-типов. Диссоцианты различались морфологией колоний и некоторыми физиолого-биохимическими, биотехнологическими и пробиотическими характеристиками. Наибольшей устойчивостью к антибиотикам у всех штаммов обладали диссоцианты Sm-типа. Высокой продуктивностью экзополисахаридов у лактобацилл отличались диссоцианты Sb-типа, у энтерококков — S-типа. Наивысшую антибактериальную активность демонстрировали Sm-вариан-ты лактобацилл, особенно у штамма Lactobacillus sp. М76АТ. Биотехнологически наиболее перспективен штамм Lactobacillus sp. М76АТ, все диссоцианты которого при сбраживании молока давали продукты с одинаково хорошо выраженными функциональными и органолептическими свойствами. Выявленные закономерности важны для понимания механизмов антибиотикоустойчивости бактерий, а в практическом аспекте для селекции диссоциантов с необходимыми свойствами и контроля качества заквасок молочнокислых бактерий.
Ключевые слова: молочнокислые бактерии, Lactobacillus, Enterococcus, антибиотики, канамицин, ампициллин, внутрипопуляционная вариабельность, диссоцианты.
DOI: 10.7868/S0026365614030112
Выживание и развитие разнообразных форм жизни обусловлено их адаптацией к постоянно изменяющимся условиям окружающей среды. Потенциал адаптационных способностей микроорганизмов обеспечен их внутрипопуляционной вариабельностью, которая является результатом обратимых внутригеномных перестроек и выражается в диссоциативных переходах доминантного генотипа в минорные [1—3]. Такой механизм адаптации, за счет изменения диссоциативного спектра популяции, обусловливающий выживание вида в неблагоприятных для роста условиях и селективное развитие его наиболее приспособленного к данному окружению варианта, был обнаружен и исследован нами у целого ряда микроорганизмов [4—7], в том числе молочнокислых бактерий (МКБ) [7]. Актуальность изучения по-пуляционной изменчивости МКБ мотивирована их широким использованием в качестве пробио-
1 Автор для корреспонденции (e-mail: loikonat@mail.ru).
тиков в пищевой промышленности и животноводстве [8, 9]. Стабильный спрос на кисломолочные продукты высокого качества повышает требования к заквасочным культурам МКБ [10, 11]. Они должны не только обладать рядом полезных биотехнологических характеристик, но и длительное время сохранять жизнеспособность, проявлять устойчивость к неблагоприятным воздействиям, а также быстро адаптироваться при попадании в желудочно-кишечный тракт человека и животных [12, 13]. Однако широкое применение в животноводстве антибиотиков приводит к их попаданию в молочное сырье, что неизменно влечет за собой снижение качества и безопасности молочной продукции для человека и животных [14]. Кроме того, представляет опасность необоснованное применение антибиотиков в терапии, что неблагоприятно воздействует на популяции молочнокислых бактерий в желудочно-кишечном тракте человека и является причиной развития дис бактериозов [15]. Этим мотивировано повы-
шение требований к такому критерию отбора промышленных штаммов МКБ как антибиотико-устойчивость (АУ) [16]. Использование АУ штаммов МКБ, с одной стороны, способствует стабилизации нормофлоры кишечника при проведении антибиотикотерапии, однако, с другой стороны, это может привести к переносу генов АУ от молочнокислых бактерий к патогенным микроорганизмам и быстрому распространению среди клинических штаммов резистентности к лекарственным препаратам, что, как следствие, увеличит неэффективность использования антибиотиков [17—19]. Изложенное обосновывает необходимость выяснения фундаментальных закономерностей адаптационной устойчивости МКБ к стрессорному воздействию антибиотиков, в том числе за счет выщепления АУ диссоциантов.
Целью данной работы было изучение изменения популяционного спектра МКБ при воздействии антибиотиков, выделение диссоциантов и сравнение их по ряду основных биотехнологических и пробиотических характеристик.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
Объектами исследования были 4 штамма молочнокислых бактерий (МКБ): Lactobacillus sp. М76АТ; L. casei МБ; Enterococcus faecium M; E.faecium М3185 из коллекции культур микроорганизмов кафедры технологии сахара, бродильных производств и виноделия ФГБОУ ВПО МГУПП.
Бактерии выращивали на глюкозо-дрожжевой среде (ГДС) следующего состава (г/л): дрожжевой автолизат — 20.0; глюкоза — 20.0; pH 7.0. Культивирование осуществляли в пробирках на 20 мл с 10 мл среды в статических условиях (без перемешивания) при температуре 28°С в течение 24—120 ч. Иноку-лят — культуру начала стационарной фазы роста, вносили в количестве, обеспечивающем начальную оптическую плотность (ОП) 0.1 (X = 540 нм, l = 10 мм; Specord UV VIS, "Carl Zeiss Jena", Германия).
Жизнеспособность клеток определяли по числу колониеобразующих единиц (КОЕ) при высеве клеточных суспензий из соответствующих разведений на агаризованную ГДС (1.5% агар-агара).
Антибиотикоустойчивость клеток определяли по численности КОЕ при рассеве аликвот культур ранней стационарной фазы роста (24 ч) на агаризованную глюкозо-дрожжевую среду с канамици-ном (10, 50, 100, 150 мкг/мл) или ампициллином (0.5, 1, 2, 2.5, 3 мкг/мл) в сравнении с ростом на среде без антибиотика. В этих же экспериментах определяли индекс диссоциации популяций АУ МКБ как % колоний определенного колониально-морфологического типа к общему числу колоний, а также выделяли АУ клоны определенных морфо-типов.
Стабильность выделенных антибиотикоустой-чивых колониально-морфологических диссоциан-
тов определяли по сохранению признаков морфотипа после 5 последовательных пассажей диссоциантов на агаризованной ГДС с антибиотиком.
Микроскопические наблюдения проводили с использованием микроскопа "Reichert" (Австрия) с фазово-контрастным устройством.
Определение антагонистической активности
проводили методом развивающихся смешанных культур МКБ и тест-штамма Staphylococcus aureus 209-P, сравнивая их рост с ростом тест-штамма в монокультуре [7].
Синтез экзополисахаридов (ЭПС) МКБ определяли качественно, по окраске колоний, полученных на агаризованной ГДС, с красителем рутением красным (80 мг/л). Интенсивность окрашивания колонии в красный цвет свидетельствовала о неспособности клеток продуцировать ЭПС, а белая окраска — о синтезе большого количества ЭПС [20].
Для определения функциональной активности МКБ (времени сквашивания молока) к 100 мл стерильного (автоклавирование в течение 7 мин при 0.5 атм.) молока (10%, обезжиренное) добавляли 3 мл 16-часовой культуры исследуемого диссоци-анта, тщательно перемешивали и инкубировали в термостате (28°С) для образования сгустка. За активность сквашивания принимали время образования сгустка (в ч).
Определение влагоудерживающей способности (способности к синерезису) сгустка проводили методом центрифугирования. В 200 мл стерильного молока добавляли 6 мл культуры исследуемого диссоцианта МКБ и термостатировали при температуре 37°С до образования плотного сгустка, затем охлаждали при температуре 5°С. Через 24 ч 10 мл подогретого до 20°С сгустка перемешивали до получения однородной массы, центрифугировали в течение 5 мин при 3000 об/мин. Влаго-удерживающую способность выражали в количестве (мл) сыворотки, выделившейся из 10 мл сгустка [21].
Определение энергии и предела кислотообразо-
вания. В пробирку с 10 мл стерильного обезжиренного молока вносили 1 петлю исследуемого штамма и термостатировали при оптимальной температуре (37°С) в течение 24 ч (при определении энергии кислотообразования) и 7 сут (при определении предела кислотообразования), после чего определяли титруемую кислотность [21].
Определение титруемой кислотности. Измерения проводили по ГОСТ Р 54669-2011, для этого к 10 мл пробы добавляли 20 мл дист. Н2О и 2 капли 1% фенолфталеина. Затем пробы титровали 0.1 н NaOH до появления слабо-розового окрашивания. Объем (мл) NaOH, пошедший на титрование и умноженный на 10, являлся показателем титруемой кислотности, выражаемой в градусах Тернера (°Т) [21].
Таблица 1. Жизнеспособность и диссоциативный спектр АУ клонов в популяциях МКБ, выросших на среде с антибиотиком
Антибиотик в среде роста* Индекс диссоциации, %
МКБ Вариант Концентрация, мкг/мл КОЕ/мл (% от КОЕ без антибиотика) S Sm Sb
Lactobacillus sp. М76АТ Без антибиотика 0 4.5 х 108 (100) 100 0 0
Канамицин 10 4.2 х 108 (93.3) 97.4 2.6 0
50 3.6 х 105 (0.08) 69.8 30.2 0
100 1.5 х 105 (0.03) 22.6 69.5 7.9
Ампициллин 0.5 3.8 х 108 (84.4) 98.5 1.5 0
1.0 2.1 х 108 (46.7) 86.9 13.1 0
2.0 9.3 х 107 (20.7) 65.5 34.5 0
2.5 1.2 х 103 (2.7 х 10-4) 0 100 0
L. casei МБ Без антибиотика 0 4.2 х 108 (100) 100 0 0
Канамицин 100 2.2 х 105 (0.05) 12.3 82.5 5.2
Ампициллин 2.0 9.1 х 107 (21.7) 64.7 35.3 0
Enterococcus faecium М Без антибиотика 0 5.6 х 108 (100) 100 0 0
Канамицин 10 5.4 х 108 (96.4) 98.7 1.3 0
50 5.3 х 105 (0.09) 58.6 41.4 0
100 2.6 х 105 (0.05) 14.7 79.7 5.6
Ампициллин 0.5 5.3 х 108 (94.6) 99.5 0.5 0
1.0 4.5 х 108 (80.3) 75.5 24.5 0
2.0 1.3 х 108 (23.2) 69.7 30.3 0
2.5 2.6 х 103 (4.6 х 10-4) 0 100 0
E. faecium М3185 Без антибиотика 0 6.5 х 108 (100) 100
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.