ИЗМЕНЕНИЕ ЭКСПРЕССИИ БЕЛКА MICA В УСЛОВИЯХ ЭТАНОЛ-ИНДУЦИРОВАННОГО КЛЕТОЧНОГО СТРЕССА
Стрельцова М. А., Каневский Л. М., Коваленко Е. И.
Институт биоорганической химии им. академиков М. М. Шемякина и Ю. А. Овчинникова РАН, Москва, Россия
В работе изучалось действие этанола на экспрессию стресс-индуцируемого белка MICA, лиганда активирующего рецептора NKG2D, в клетках гемопоэтического происхождения. Как известно, увеличение экспрессии MICA на поверхности окружающих клеток приводит к активации цитотоксических лимфоцитов, а возрастание количества циркулирующих форм MICA за счет их высвобождения из клеток может снижать функциональную активность лимфоцитов. В модельной системе in vitro нами было продемонстрировано, что этанол может вызывать как увеличение, так и снижение поверхностной экспрессии MICA в клетках. Было выявлено три механизма, по которым может реализо-вываться регулирующее действие этанола на экспрессию MICA. Влияние этанола на экспрессию лигандов иммунорецептора NKG2D может представлять один из способов воздействия алкоголя на функционирование клеточных звеньев как врожденного, так и приобретенного иммунитета.
Ключевые слова: этанол, иммунная система, клеточный стресс, MICA, NKG2D, цито-токсические лимфоциты
Введение. Изучение механизмов воздействия алкоголя на организм человека по-прежнему остается актуальной задачей. Как известно, основными мишенями этанола в организме являются центральная нервная система и печень. В то же время, в последнее время растет количество данных, описывающих влияние этанола на функционирование иммунной системы. Этанол оказывает воздействие на различные клеточные звенья как врожденного, так и приобретенного иммунитета. Под действием этанола уменьшается количество нейтрофилов, Т-лимфоцитов, супрессируется функционирование костного мозга, NK-клетки теряют свою цитотоксиче-скую активность [1]. Однако влияние алкоголя на иммунитет человека изучено не полностью. Недостаточно также данных о механизмах действия этанола на иммунные клетки.
Известно, что этиловый спирт способен оказывать повреждающее влияние на клетки [2, 3]. Его прямое токсическое действие основано в первую очередь на способности непосредственно взаимодействовать с неэтерифици-рованными жирными кислотами и вызывать конформационные изменения различных биологически значимых молекул. В свою очередь,
это может приводить к развитию клеточного стресса и вызывать разнообразные ответные клеточные реакции. Возможным механизмом влияния этанола на клетки является повышение текучести плазматической мембраны за счет воздействия на холестериновые компоненты мембран, приводящее к нарушению ассоциации липидных рафтов с мембранными белками [4].
Одной из реакций клетки на стресс является индукция экспрессии белка MICA и его близкого гомолога MICB, в норме слабо представленных на поверхности клеток. Эти белки принадлежат к группе лигандов активирующего рецептора цитотоксических лимфоцитов NKG2D. Молекула MICA представляет собой высокогликозилированный заякоренный в мембране поверхностный белок, который экспрессируется в отсутствие бета-2-микроглобулина и не связывает пептиды [5]. Взаимодействие белков MICA/B, экс-прессированных на клеточной поверхности, с рецептором NKG2D приводит к активации NK-клеток и цитотоксических Т-лимфоцитов и уничтожению измененных клеток [6]. В то же время, растворимые формы этих белков могут оказывать ингибирующее действие на работу
иммунной системы за счет снижения в лимфоцитах экспрессии NKG2D [7]. Циркулирующие формы белка MICA могут обнаруживаться в сыворотке онкологических больных [8].
Недавно нами было показано, что этанол способен вызывать как индукцию поверхностной экспрессии MICA/В в клетках миелоид-ного происхождения, так и элиминацию указанных белков с клеточной поверхности [9]. Можно предположить, что изменение экспрессии MICA/B под действием этанол-индуциро-ванного клеточного стресса представляет собой один из способов воздействия этилового спирта на иммунную систему. Механизмы опосредованной этанолом регуляции поверхностной экспрессии и элиминации MICA из клеток до сих пор не раскрыты. Целью данной работы являлось изучение механизмов действия этанола на поверхностную экспрессию белков MICA в условиях клеточного стресса в модельной системе in vitro с использованием линий клеток гематопоэтического ряда.
Материал и методы. Для оценки влияния этанола на экспрессию MICA в работе использовались следующие человеческие опухолевые клеточные линии: K562 - эритромиелобласт-ная лейкемия, Jurkat - Т-клеточная лейкемия, THP-1 - острая моноцитарная лейкемия. Клетки культивировали в среде RPMI-1640 с добавлением 2 мМ L-глутамина, 1 мМ пирувата натрия, антибиотика-антимикотика 1:100 (все Sigma-Aldrich, США) и 10% телячьей эмбриональной сыворотки HyClone (Thermo Scientific, США) при 37 °C в атмосфере 5% СО2.
Клетки инкубировали в присутствии этанола (0.5-2%) в течение 3 и 18 ч, затем дважды отмывали в питательной среде. Для оценки поверхностной экспрессии белка MICA в контрольных и обработанных этанолом клетках их метили первичными антителами к MICA (R&D Systems) с последующей окраской флуоресцент-номечеными вторичными антителами либо прямомечеными антителами анти-MICA. Для анализа внутриклеточной экспрессии MICA клетки предварительно фиксировали и перме-абилизировали. Далее клетки анализировали методом проточной цитометрии с использованием цитометра FACScan (Becton Dickinson, США), не менее 5000 событий в регионе, соответствующем живым клеткам. Полученные данные обрабатывали с помощью специализированных программ для обсчета цитометриче-ских данных CellQuest и WinMDI.
Анализ внутриклеточной и поверхностной экспрессии белков MICA и MICB и их коло-кализацию с белками теплового шока 70 кДа (HSP70) проводили с использованием конфокального микроскопа Eclipse TE2000-E, (Nikon, Япония), оснащенном лазерами с длинами волн 405, 488 и 543 нм. Клетки фиксировали, пермеабилизировали и обрабатывали меченными AlexaFluor488 антителами к MICA, и (или) первичными антителами к HSP70 (BRM22, Sigma-Aldrich, США) с последующей окраской вторыми антителами, меченными AlexaFluor555, и красителем Hoechst 33342. Получение изображений и дальнейший просмотр проводили с помощью программы "EZ-C1 for Nikon C1 confocal microscope".
Для выделения тотальной РНК из клеток использовали метод выделения РНК из клеток с помощью лизиса и последующей экстракции РНК [10]. мРНК mica/b выделяли методом обратной транскрипции, далее проводили полимеразную реакцию и агарозный гель-электрофорез.
Результаты и обсуждение. Ранее нами было продемонстрировано увеличение поверхностной экспрессии белков MICA в ряде клеток гематопоэтического происхождения под действием этанола в диапазоне концентраций 0.5-3% [9]. Для изучения механизмов обнаруженной этанол-индуцированной экспрессии MICA было проведено окрашивание поверхностного и внутреннего пула этого белка в клетках THP-1 и К562. Изменения в содержании MICA оценивали через 18 ч после добавления 1% этанола методом лазерной конфокальной микроскопии. В контрольных образцах было выявлено значительное количество внутриклеточного белка MICA при его невысокой поверхностной экспрессии. Полученные результаты подтверждают литературные данные, свидетельствующие о существовании в некоторых клетках внутриклеточного пула MICA [11]. Под действием этанола поверхностная экспрессия MICA увеличивалась, а внутриклеточная уменьшалась. Данные конфокальной микроскопии были подтверждены с помощью проточной цитометрии. Возможно, одним из механизмов увеличения экспрессии MICA под действием этанола является перераспределение пулов этих белков, при этом внутриклеточные белки перемещаются на клеточную поверхность.
В клетках Jurkat не было зарегистрировано изменения внутриклеточного пула MICA под действием этанола, в то время как поверхностная экспрессия этого белка увеличивалась. Это могло быть вызвано увеличением транскрипции гена mica и последующего синтеза белка в клетках Jurkat. Поэтому следующей задачей, поставленной в исследовании, являлось выяснение, индуцирует ли этанол транскрипцию mica в клетках в данной экспериментальной системе. Была проведена серия экспериментов по оценке уровня мРНК в клетках Jurkat, подвергнутых обработке разными дозами этанола. Матричную РНК выделяли через 3 ч после начала инкубации клеток Jurkat с этиловым спиртом. Добавление к клеткам этанола (1-2%) вызывало увеличение уровня мРНК mica. Можно предположить, что это должно приводить к росту количества белка MICA. Однако, с помощью конфокальной микроскопии не было зарегистрировано изменения внутриклеточного пула MICA, в то же время поверхностная экспрессия MICA увеличивалась. Следовательно, вновь синтезированные белки перемещались на поверхность. Таким образом, индукция генной экспрессии mica в условиях вызванного этанолом клеточного стресса может служить еще одним механизмом, лежащем в основе изменения поверхностной экспрессии MICA под действием этанола.
Поскольку известно, что этанол повышает текучесть клеточной мембраны и оказывает влияние на липидные рафты, было сделано предположение, что один из механизмов действия этанола на поверхностную экспрессию MICA может быть связан с его мембранотроп-ными эффектами. В серии экспериментов нами была исследована локализация белков MICA и HSP70 методом конфокальной микроскопии на цитоплазматической мембране клеток THP-1, в которых экспрессируется значительное количество данных белков. По некоторым данным, обнаруживаемые в ряде случаев на клеточной мембране белки HSP70 находятся в составе липидных рафтов [12]. Представленные на клеточной поверхности белки MICA также могут быть ассоциированы с липидны-ми рафтами. На поверхности необработанных клеток THP-1 была обнаружена значительная степень колокализации белков MICA и HSP70, свидетельствуя в пользу того, что белки MICA находятся на мембране этих клеток в ассоциированном с липидными рафтами состоянии.
В результате обработки этанолом колокали-зация белков уменьшалась. Следовательно, этанол нарушал опосредованную липидными рафтами ассоциацию MICA и HSP7
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.