РОССИЙСКИЙ ИММУНОЛОГИЧЕСКИЙ ЖУРНАЛ, 2009, ТОМ 3(12), № 3-4, с. 273-279
ОРИГИНАЛЬНАЯ СТАТЬЯ
ИЗМЕНЕНИЕ ЭКСПРЕССИИ CD4, CD8, CD25 И CD28 МАРКЕРОВ НА Т-ЛИМФОЦИТАХ ПОСЛЕ ПОЛИКЛОНАЛЬНОЙ АКТИВАЦИИ В ДИНАМИКЕ КЛЕТОЧНЫХ ДЕЛЕНИЙ IN VITRO
© 2009 г. В.И. Борисов, Е.А. Блинова, В.С. Кожевников
НИИ клинической иммунологии СО РАМН, г. Новосибирск, Россия Поступила: 03.07.2009. Принята: 05.08.2009
В данной работе исследовалась экспрессия CD4, CD8, CD25 и CD28 маркеров на Т-лим-фоцитах у доноров при поликлональной активации анти-CD3 антителами с добавлением ИЛ-2 в динамике клеточных делений in vitro. Оценку количества совершенных делений, выявляемых витальным красителем CFSE, и экспрессию CD антигенов проводили на проточном цитофлуориметре. В результате проведенных исследований было обнаружено, что на 7-е сутки лимфоциты максимально совершают 5 делений, и в большей степени про-лиферируют CD8 + лимфоциты. Уровень апоптоза для CD4+ лимфоцитов совершивших 4-5 делений резко увеличивается, в отличие от CD8+ лимфоцитов. Это приводит к резкому изменению субпопуляционного состава в культуре: снижается количество CD4+ и увеличивается количество CD8+ клеток. После 2 делений происходит снижение количества как CD4+CD25 + , так и CD8+CD25+ лимфоцитов и резкое нарастание CD4+CD28", тогда как CD8+CD28- изменяется незначительно, в независимости от количества совершенных делений. Полученные данные указывают на то, что субпопуляция CD4+ лимфоцитов менее быстро отвечает на стимуляцию и более быстро «стареет» при культивировании in vitro относительно CD8+ лимфоцитов, что приводит к резкому изменению субпопуляционно-го состава уже на 7-е сутки. Поэтому использование культивированных лимфоцитов для модулирования иммунных реакций, как in vitro, так и in vivo должно сопровождаться тщательным изучением их особенностей.
Ключевые слова: Т-лимфоциты, пролиферация in vitro, CFSE, витальный краситель
ВВЕДЕНИЕ
Во множестве исследований, как in vitro, так и in vivo было выявлено значение костимуля-торных сигналов при Т-клеточной активации [ 1 — 3]. Общим в изучаемых моделях была недостаточность стимуляции Т-лимфоцитов только через Т-клеточный рецептор (ТКР) для полной активации Т-клеточного ответа. В дополнение к взаимодействию ТКР со специфическим антигеном необходим второй кости-муляторный сигнал, который поступает при лиганд-рецепторном взаимодействии клеток
[4].
Наиболее важный Т-клеточный костимуля-торный путь опосредован взаимодействием CD28 рецептора, экспрессируемого Т-лимфо-цитами, с CD80 (B7.1) или CD86 (B7.2) лиган-
Адрес: 630099, г. Новосибирск, ул. Ядринцевская, 14. E-mail: blinovaelena-85@yandex.ru
дами, представленными на различных типах клеток, в том числе и на антигенпрезентирую-щих клетках [5, 6].
Отсутствие B7 лиганда на клетках антигенной опухоли препятствует формированию противоопухолевого иммунного ответа, что сопровождается прогрессивным ростом этих клеток. Однако трансфекция гена B7 не только восстанавливает иммуногенность данных опухолей, но и приводит к подавлению их роста in vivo [7 — 9].
Взаимодействие CD28 на Т-лимфоцитах с B7 на антигенпрезентирующих клетках увеличивает продукцию цитокинов Т-клетками путем дополнительной стабилизации мРНК этих молекул, в частности для ИЛ-2 в 20-30 раз, и усиление транскрипции их генов [10]. Ингибирование образования комплекса B7:CD28 блокирует иммунный ответ in vitro и in vivo, приводит к клональной инактивации, крайне низкому уровню продукции ИЛ-2 и
других цитокинов у Т-лимфоцитов и развитию анергии [5, 11].
В клетке, получившей двухсигнальную активацию, начинаются синтез и секреция интерлейкина-2 (ИЛ) и одновременная экспрессия на поверхности а-цепи рецептора к нему — CD25. ИЛ-2, взаимодействуя с собственным рецептором, обеспечивает быстрое размножение Т-лимфоцитов и диф-ференцировку наивных Т-клеток до зрелых эффекторов. Помимо того, что экспрессия CD25 необходима для адекватного ответа на антиген, она способствует продукции ИЛ-10, который участвует в развитии гуморального иммунитета и блокирует цитотоксический иммунитет [12].
Как видно из приведенных данных, экспрессия CD25 и CD28 на поверхности лимфоцитов является критически важной для реализации ими своих функций.
На сегодняшний день все чаще применяется Т-клеточная вакцина на основе аутоак-тивированных Т-лимфоцитов для лечения и коррекции иммунологических расстройств [13—17]. Ясно, что ожидаемый эффект может зависеть от функционального состояния вводимых в организм клеток. Однако в литературе практически нет данных об изменении экспрессии поверхностных маркеров на лимфоцитах в динамике делений in vitro помимо того, что при активации и последующем культивировании изменяется спектр продуцируемых Т-клетками цитокинов в зависимости от количества клеточных делений, вплоть до переключения между Th1 и Th2 ответом [18].
В данной работе исследовали изменения уровня апоптоза и количества CD4+, CD8 + , CD25 + и CD28+ Т-лимфоцитов, культивированных по стандартному протоколу получения вакцины с добавлением ИЛ-2 и анти-CD3 антител в течение 7 суток в зависимости от количества пройденных делений in vitro. Экспрессия CD маркеров менялась таким образом, что общая популяция лимфоцитов в разное время состояла из субпопуляций определенного фенотипа с разным количественным соотношением.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
Метод получения лейкоцитов периферической крови
Лейковзвесь, полученную после осаждения эритроцитов в присутствии 1% желатина в термостате при 37°С, наслаивали на
градиент плотности фиколл-верографина и центрифугировали при 3000 об/мин в течении 15 минут. Осадок двукратно отмывали забуференным физиологическим раствором (ЗФР), суспендировали в 1 мл ЗФР и подсчитывали количество клеток в камере Горяева.
Определение количества делений
Перед культивированием лимфоциты окрашивали витальным красителем CFSE (Molecular probes, USA) с конечной концентрацией 2 мкМ в RPMI 1640 15 минут, затем отмывали в RPMI с 10% FCS (HyClone, UK). Анализ количества делений проводили на проточном ци-тофлуориметре FACS Calibur (Becton Dickinson, USA) по каналу FL1 флуоресценции CFSE с эмиссией 517 нм.
Культивирование лимфоцитов
Клетки переносили в 24-луночный планшет (TPP, Switzerland) в количестве 2 млн на 1 мл полной среды (RPMI, FCS 10%, глютамин 0,3 мг/мл, гентамицин 50 мкг/мл, тиенам 25 мкг/мл) с добавлением arn^CD3 антител 1 мкг/мл (МедБиоСпектр, Россия) и ИЛ-2 100 ед/мл (Биотех, Россия).
Определение количества CD4+, CD8+, CD25+ и CD28+ лимфоцитов
На 7-е сутки культивирования клетки снимали, отмывали ЗФР и метили анти-СD4, -CD8, -CD25 и -CD28 антителами по 20 мкл (Becton Dickinson, USA) в течение 20 минут при комнатной температуре, с последующей отмывкой ЗФР и четырехцветным анализом на проточном цитофлуориметре.
Определение уровня апоптоза
Уровень апоптоза определяли с помощью ДНК-интерколирующего красителя 7-AAD (ICN Biomedicals Inc, USA). Клетки обрабатывали раствором РНКазы А 20 мкг/мл (Sigma, USA) и 2 мкл/мл 7-AAD. Лимфоцитарную и моноцитарную область выделяли по параметрам прямого и бокового светорассеивания. С помощью гистограммы по каналу флуоресценции соответствующего флуорохрома определялся гейт отдельных субпопуляций клеток. Затем методом последовательного гейтирования с помощью трехцветной проточной цитофлуориметрии строили одномерную гистограмму по каналу FL3-A, на которой
апоптотичные клетки определяли как клетки с гиподиплоидным набором ДНК. Результат выражали в виде процентного соотношения позитивных клеток к общему количеству лимфоцитов в исследуемой области [19].
РЕЗУЛЬТАТЫ
При анализе культуры лимфоцитов до и после культивирования оказалось, что на 7-й день происходит снижение количества СБ4+ лимфоцитов с 44,5 ± 5,4% до 35,7 ± 6,5% и увеличение СБ8 + лимфоцитов с 20,8 ± 2,3% до 44,4 ± 3,6% (р < 0,01, п = 5), соответственно. Суммарный уровень апоптоза повысился в обеих популяциях: для СБ4+ с 0,24% до 1,12% (р < 0,05) и для СБ8 + с 0,45% до 0,77% (р = 0,07).
Количество клеток, экспрессирующих маркер СБ25, после культивирования резко увеличилось как среди СБ4+, так и среди СБ8 + лимфоцитов. Интересно, что без активации количество СБ4+СБ25 + в три раза превышало количество СБ8 + СБ25 + (р < 0,05), тогда как после активации их количества стали практически одинаковы.
Для СБ28 маркера отмечена лишь тенденция к снижению после культивирования в обеих субпопуляциях СБ4+ и СБ8 + лимфоцитах (рис. 1).
Определение количества клеточных делений
Количество клеточных делений определяли с помощью витального красителя СББЕ [20]. Принцип дискриминации отдельных клеток, прошедших разное количество делений, ос-
• Среднее □ ±СтОш I ±СтД
CD4+ CD25+
CD4+ CD28+
CD8+ CD25+
CD8+ CD28+
о в о о 1
Ml
о Л 1
CFSE 1 1 1 1 1 1 1 ||' II ■HHI 111II 1 1 1 1 1
М2
Рис. 1. Изменение количества СБ4+СБ25 + , СБ4 + СБ28 + (А) и СБ8 + СБ25+, СБ8+СБ28+ (Б) лимфоцитов. Примечание: *р <0,01; • — до культивирования, □ — после культивирования.
Рис. 2. Гистограмма флуоресценции неокрашенных (М1) и окрашенных (М2) клеток витальным флуоресцентным красителем CFSE (А). Гистограмма флуоресценции клеток, окрашенных CFSE, прошедших 5 делений in vitro (Б).
нован на том, что в момент деления краска распределяется одинаково между дочерними клетками, каждая из которых содержит в два раза меньше краски, чем материнская клетка. В результате неделившиеся клетки имеют максимальный уровень флуоресценции, а клетки, совершившие максимальное количество делений, светятся наименее ярко (рис. 2).
На гистограмме пики популяций клеток, прошедших разное количество делений, расходятся только вершинами, а в основании сливаются воедино. Происходит это в результате того, что популяция Т-лимфоцитов достаточно неоднородна по размеру клеток, т.е. и по аутофлуоресценции, что приводит к значительной разнице между минимумом и максимумом светимости и имеет нормальное распределение. Поэтому анализ такой гистограммы проводился с помощью специальной полуавтоматической программы Cyflogic (© CyFlo Ltd). Пример такого анализа показан на рисунке 3.
Рис. 3. Двухцветное распределение лимфоцитов
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.