МОЛЕКУЛЯРНАЯ БИОЛОГИЯ, 2013, том 47, № 6, с. 996-1003
МОЛЕКУЛЯРНАЯ БИОЛОГИЯ КЛЕТКИ
УДК 577.2
ИЗМЕНЕНИЕ ЭКСПРЕССИИ ГЕНА И СОДЕРЖАНИЯ ТАЙТИНА (КОННЕКТИНА) В ПОПЕРЕЧНО-ПОЛОСАТЫХ МЫШЦАХ ХРОНИЧЕСКИ АЛКОГОЛИЗИРОВАННЫХ КРЫС
© 2013 г. Ю. В. Грицына1, Н. Н. Салмов1, И. М. Вихлянцев1*, А. Д. Уланова1,2, М. Г. Шарапов3,
В. В. Теплова1, З. А. Подлубная12
Институт теоретической и экспериментальной биофизики Российской академии наук,
Пущино, Московская обл., 142290 2Пущинский государственный естественно-научный институт, Пущино, Московская обл., 142290 3Институт биофизики клетки Российской академии наук, Пущино, Московская обл., 142290
Поступила в редакцию 17.04.2013 г. Принята к печати 25.05.2013 г.
Методами обратной транскрипции — полимеразной цепной реакции в реальном времени и гель-электрофореза в денатурирующих условиях изучены изменения экспрессии гена и изоформного состава гигантского саркомерного белка тайтина (коннектина) в сердечной мышце, а также изменения изоформного состава этого белка в скелетной мышце soleus хронически алкоголизированных крыс. Обнаружено снижение содержания белка тайтина в этих мышцах, а также экспрессии его гена в миокарде хронически алкоголизированных животных, что указывает на развитие патологического процесса.
Ключевые слова: изоформы тайтина, ген Ш, тяжелые цепи миозина, поперечно-полосатые мышцы, хронически алкоголизированные крысы.
CHANGES IN GENE EXPRESSION AND CONTENT OF TITIN (CONNECTIN) IN STRIATED MUSCLES OF CHRONICALLY ETHANOL-FED RATS, by Yu. V. Gritsyna1, N. N. Salmov1, I. M. Vkhlyantsev1, A. D. Ulanova1'2, M. G. Sharapov3, V. V. Teplova1, Z. A. Podlubnaya1'2 ^Institute of Theoretical and Experimental Biophysics, Russian Academy of Sciences, Pushchino, Moscow region, 142290 Russia, *e-mail: vikh-lyantsev@iteb.ru; 2Pushchino State Institute of Natural Sciences, Pushchino, Moscow region, 142290 Russia; 3Institute of Cell Biophysics, Russian Academy of Sciences, Pushchino, Moscow region, 142290 Russia). Changes in gene expression and isoform composition of giant sarcomeric protein titin (connectin) in cardiac muscle, as well as changes of its isoform composition in skeletal muscle (m. soleus) of chronically ethanol-fed rats have been studied using real-time RT-PCR and low percentage SDS-gel electrophoresis. The decrease of titin content in examined muscles and the decrease in titin gene expression in myocardium of chronically etha-nol-fed rats have been shown. These changes indicate the development of pathologic process.
Keywords: titin isoforms, gene of titin ttn, myosin heavy chains, striated muscles, chronically ethanol-fed rats. DOI: 10.7868/S0026898413060050
Известно, что хроническая алкогольная интоксикация приводит к развитию симптомокомплек-са алкоголь-индуцированного поражения как скелетных (алкогольная миопатия), так и сердечной (алкогольная кардиомиопатия) мышц [1—3]. Основные характеристики алкоголь-индуцирован-ных нарушений в мышцах успешно моделируются на животных, в частности на крысах [4—6]. Показано, что у человека и животных развитие алкогольной миопатии/кардиомиопатии сопровожда-
Принятые сокращения: ДСН — додецилсульфат натрия; ОТ — ция; Т2 — протеолитический фрагмент тайтина.
* Эл. почта: vikhlyantsev@iteb.ru
ется атрофией и слабостью скелетных мышц, нарушением сократительных свойств сердечной мышцы [1—4, 7]. Свой вклад в эти изменения вносит снижение общего содержания РНК, ДНК и белка (например, тяжелых цепей миозина, актина, десмина, тропонина-1) [4, 5, 8, 9], а также нарушение функциональных свойств сократительных белков, в частности снижение активируемой актином АТРазной активности миозина [10]. Молекулярный механизм развития алкоголь-инду-
обратная транскрипция; ПЦР — полимеразная цепная реак-
цированных нарушений в мышцах не ясен, однако показано, что этанол и, главным образом, продукт его окисления ацетальдегид участвуют как в подавлении белкового синтеза путем токсического поражения ряда ключевых звеньев сигнальной системы шТОЯ, так и в активации протеолиза [2, 7, 11-14].
Важным компонентом саркомеров поперечнополосатых мышц позвоночных является тайтин (титин, коннектин) — гигантский эластичный белок, формирующий третий тип нитей в миофиб-риллах (для ссылок см. [15—17]). Молекулы тайти-на длиной около 1 мкм и диаметром 3—4 нм перекрывают половину саркомера от М-линии до Z-диска. В А-зоне саркомера тайтин связан с мио-зиновыми нитями. В 1-зоне саркомера некоторые участки тайтина взаимодействуют с актиновыми нитями, однако большая часть его молекулы в этой зоне проходит свободно, соединяя концы миозиновых нитей с Z-диском. Молекула тайтина на ~ 90% состоит из повторяющихся иммуноглобулин-подобных (1§С2) и фибронектин-подобных ^пШ) доменов с Р-складчатой структурой. Кроме этих доменов тайтин содержит киназный домен вблизи М-линии саркомера и уникальные эластичные МА-, №В- и РЕУК-элементы в 1-зоне саркомера (для ссылок см. [17]). Гигантские размеры тайтина, его расположение во всех зонах сарко-мера, эластичные свойства и уникальная структура молекулы создают основу для многофункциональности этого белка. Показано, что тайтин служит каркасом для сборки толстых нитей и саркомера; участвует в поддержании высокоупорядоченной саркомерной структуры и, вследствие этого, сократительной функции мышцы; вносит вклад в пассивное напряжение, возникающее при растяжении мышцы, и развивает возвратную силу при сокращении саркомера; участвует в запуске и регуляции актин-миозинового взаимодействия и регуляции процессов внутриклеточной сигнализации (для ссылок см. [17, 18]). В поперечно-полосатых мышцах млекопитающих и человека ген тайтина кодирует несколько изоформ: №В, М2ВЛ и МЛ с молекулярной массой их изовари-антов 3000—3700 кДа (см. обзор [17]). Недавно в мышцах мутантных крыс обнаружены изовари-анты тайтина, молекулярные массы которых превышают 3700 кДа [19]. Нами было показано, что в поперечно-полосатых мышцах млекопитающих наряду с изоформами №В, №ВА и МЛ, присутствуют и более высокомолекулярные изоформы тайтина, названные МТ-изоформами [17]. За последние годы установлена важная роль изоформ-ных изменений тайтина в адаптации мышечной системы млекопитающих к условиям гибернации и микрогравитации [17, 20—25], а также участие этого белка в патогенезе ряда мышечных заболеваний [17, 26—33]. В частности, нами обнаруже-
но, что при развитии ряда патологических процессов в мышцах человека и животных наряду с изменением экспрессии гена тайтина происходит разрушение NT-изоформ этого белка, что вносит основной вклад в нарушение упорядоченной саркомерной структуры и снижение сократительной способности мышцы [17, 28, 31].
В представленной работе изучены изменения экспрессии гена тайтина, а также содержания его N2B-, N2BA-, N2A- и NT-изоформ в сердечной и скелетной (m. soleus) мышцах хронически алкого-лизированных крыс.
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ
Хроническая алкоголизация крыс. В работе использовали самцов белых лабораторных крыс линии Wistar. Масса каждого животного вначале эксперимента составляла 150 гр. Животных содержали в отдельных клетках в условиях вивария ИТЭБ РАН (Пущино). Проведение опытов на животных было одобрено комиссией по биомедицинской этике ИТЭБ РАН. Методика алкоголизации крыс разработана на основе модели хронической алкогольной интоксикации [34]. Животные были разделены на две группы: контрольную ("Контроль", n = 5), в которой крысы получали стандартный пищевой рацион и питьевую воду, и опытную, в которую вошли хронически алкоголизированные крысы ("Алкоголь", n = 5), получающие стандартный пищевой рацион и 20%-ный раствор этанола в качестве единственного источника жидкости в течение 6 мес. Привыкание животных к алкоголю развивали, постепенно увеличивая содержание этанола в питьевой воде. В частности, в течение первых 3 сут оно составляло 5%, в последующие 3 сут — 10 и 15%, соответственно, а далее — 20%. Через 6 мес. животных взвешивали и выводили из эксперимента. В дальнейшем использовали миокард левого желудочка и скелетную мышцу soleus. Образцы мышц хранили при температуре —70°С.
Выделение РНК из ткани миокарда крыс проводили с использованием набора AurumTMTotal RNA Fatty and Fibrous Tissue Kit ("Bio-Rad", США) согласно протоколу изготовителя. Качество РНК определяли по сохранности 18S и 28S рРНК с помощью электрофореза в 1%-ном агарозном геле. Концентрацию РНК определяли спектрофотомет-рически (спектрофотометр Nano Drop ND-1000, "NanoDrop Technologies", США). Раствор РНК хранили при температуре -70°С.
Обратная транскрипция и ПЦР в реальном времени. Реакцию обратной транскрипции проводили на суммарной РНК (концентрация 0.5 мкг/мкл) с использованием обратной транскриптазы Mint ("Евроген", Россия) и стандартного праймера
олиго-ёТ15. Полученную кДНК использовали в ПЦР с праймерами, специфичными к гену тайти-на (ttn), кодирующему разные изоформы этого белка, в частности N2B и N2BA. Нуклеотидные последовательности праймеров, синтезированных фирмой "Евроген" (Россия) на основе известной последовательности гена тайтина крысы [35], приведены в табл. 1. Температура отжига праймеров для изоформ тайтина составляла 64° С.
ПЦР в реальном времени проводили на ампли-фикаторе ДТ-322 ("ДНК-Технология", Россия) c использованием ДНК-полимеразы Tersus ("Евро-ген", Россия) и SYBR Green I ("Invitrogen") в качестве флуоресцентного красителя. Режим ПЦР был следующим: (1) "горячий старт" — 95°С, 5 мин; (2) денатурация — 95°С, 15 с; (3) отжиг праймеров — 64°С, 20 с; синтез — 72°С, 20 с. Этапы 2—4 повторяли 35 раз. В качестве референсного гена (housekeeping gene) использовали ген фактора элонгации EF-1а [36]. Продукты амплификации анализировали с помощью электрофореза в 8%-ном полиакрила-мидном геле (рис. 1). Изменение экспрессии гена ttn рассчитывали по методу 2-AAQ согласно [37]. Значения AACt рассчитывали по формуле AACt = ACt (кон_ троль) — ACt (опыт), каждое значение ACt рассчитывали по формуле ACt = Ct (ttn) -Ct (референсный ген). Q -пороговый цикл.
ДСН-гель-электрофорез. Для электрофорети-ческого разделения высокомолекулярных изо-форм тайтина в присутств
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.