УДК 575.113.5
ИЗМЕНЕНИЕ ЭКСПРЕССИИ РАФТ-ОБРАЗУЮЩЕГО БЕЛКА ФЛОТИЛЛИНА-2 В АДЕНОКАРЦИНОМАХ ЛЕГКОГО ЧЕЛОВЕКА
И ЕГО ВЛИЯНИЕ НА СВОЙСТВА КЛЕТОК ЛИНИИ А549 © 2012 г. А. Н. Шнейдерман1*, К. К. Лактионов2, Б. Е. Полоцкий2, И. Б. Зборовская1
1НИИканцерогенеза Российского онкологического научного центра им. Н.Н. Блохина РАМН,
Москва, 115478, Каширское шоссе, д. 24; *электронная почта: shneyderman.an@gmail.com 2НИИклинической онкологии Российского онкологического научного центра им. Н.Н. Блохина РАМН,
Москва, 115446, Каширское шоссе, д. 23 Поступила в редакцию 15.12.2011 г.
Большое количество клеточных сигналов передается при помощи особых микродоменов плазматической мембраны, называемых липидными рафтами. Липидные рафты представляют собой динамичные и короткоживущие структуры, которые могут стабилизироваться рафт-образующими белками. Среди этих белков выделяют семейство флотиллинов, состоящее из флотиллинов-1 и -2. Эти белки широко представлены в различных тканях человека и регулируют множество сигнальных путей, однако их роль в процессах канцерогенеза практически не изучена. Нами изучены изменения экспрессии гена флотиллина-2 в образцах аденокарциномы легкого человека как на уровне мРНК, так и на уровне белка, а также влияние флотиллина-2 на свойства линии клеток А549 аденокарциномы легкого человека. Выявлено снижение уровня мРНК флотиллина-2 в подавляющем большинстве (85%) образцов аденокарциномы легкого по сравнению с условно нормальной тканью, однако содержание белка флотиллина-2 сильно варьировало и чаще повышалось (40%), чем снижалось (15%). Суперэкспрессия флотиллина-2 в клеточной линии А549 не влияла на скорость пролиферации клеток, но усиливала их миграционную способность. В свою очередь, подавление экспрессии флотиллина-2 с помощью малых шпилечных РНК снижало как скорость деления, так и способность клеток к миграции. Результаты данной работы свидетельствуют об изменении экспрессии флотиллина-2 в аденокарциномах легкого человека и о его влиянии на важнейшие характеристики опухолевых клеток.
Ключевые слова: липидные рафты, флотиллины, немелкоклеточный рак легкого.
Плазматическая мембрана клеток не только ограничивает содержимое клетки от межклеточного пространства, но и обеспечивает обмен веществ с окружающей средой, отвечает за передачу сигналов от внеклеточного матрикса, соседних клеток, а также поступающих извне в виде различных сигнальных молекул. Это осуществляется за счет богатых холестерином и сфинголипидами микродоменов, называемых липидными рафтами. Липидные рафты — маленькие, динамичные и короткоживущие структуры, которые могут сливаться друг с другом и стабилизироваться за счет особых рафт-образующих белков [1]. Стабилизированные липидные рафты могут выполнять роль сигнальных "платформ" и регулировать пути передачи сигналов, концентрируя молекулы различных каскадов и обеспечивая их взаимное влияние друг на друга. Множество сигнальных путей, в частности, от рецепторов ростовых факторов, белков межклеточных и фокальных кон-
тактов, О-белков регулируется при помощи ли-пидных рафтов [2].
В настоящее время известно большое число рафт-образующих белков. К ним относятся ка-веолины, флотиллины, стоматин и стоматин-по-добные белки, прохибитины, подоцин, эрлины, ретикулоны и тетраспанины [3]. Наиболее хорошо изучены белки семейства кавеолинов, которые образуют липидные рафты особого типа, способные формировать кавеолы. Кавеолы представляют собой омегаобразные впячивания плазматической мембраны диаметром от 50 до 100 нм, которые обнаруживаются во многих типах клеток [4]. Так, ими особенно богаты адипоциты, эндо-телиальные клетки, пневмоциты I типа, фибро-бласты, клетки гладкой и поперечно-полосатой мышечной ткани. Кавеолы участвуют в таких важнейших процессах, как везикулярный транспорт, поддержание гомеостаза холестерина, регуляция транспорта ионов Са2+ из внеклеточного пространства в цитоплазму, а также влияют на пе-
редачу различных сигналов внутрь клетки за счет регуляции активности участников сигнальных путей [5].
Белки семейства флотиллинов весьма сходны с кавеолинами. В первую очередь, по способности к олигомеризации, благодаря которой молекулы одного типа формируют крупные комплексы, влияющие на структуру липидного бислоя. Во-вторых, белки обоих семейств не пронизывают мембрану, а лишь частично встраиваются в ее внутренний слой за счет гидрофобных участков и модификаций липидов. В-третьих, и кавеолины, и флотиллины способны связывать холестерин, который играет ключевую роль в формировании мембранных микродоменов. Кроме того, они сходным образом локализуются в клетке, обнаруживаясь в основном на плазматической мембране, а также встречаются в аппарате Гольджи, эн-досомах, мультивезикулярных тельцах, лизосо-мах и фагосомах. Флотиллины представлены практически во всех типах тканей взрослого организма, включая нервную систему и клетки крови, в которых кавеолинов нет [6]. Флотиллины и образованные ими липидные рафты участвуют в везикулярном транспорте, реорганизации актино-вого цитоскелета, они могут регулировать передачу сигналов от рецепторов факторов роста, О-белков и Т-клеточных рецепторов [7].
К семейству флотиллинов относятся два белка — флотиллины-1 и -2, обладающие высокой степенью гомологии аминокислотных последовательностей и молекулярной массой 47 кДа. Они не имеют внутри- или трансмембранного домена, однако связываются с внутренним слоем клеточных мембран за счет М-концевых гидрофобных участков и остатков жирных кислот. Флотиллин-1 подвергается пальмитилированию лишь по одному аминокислотному остатку (Су834), а флотил-лин-2 — по нескольким (Су84, Су819 и Су820), а также миристилируется по остатку О1у2. Мири-стилирование является необратимой модификацией, поэтому флотиллин-2 связан с плазматической мембраной конститутивно. В то же время флотиллин-1 способен перемещаться к различным внутриклеточным компартментам, где он обнаруживается чаще, чем в составе плазматической мембраны [8].
Несмотря на возрастающий интерес к рафт-образующим белкам, их роль в нормальной и патологической физиологии человека остается плохо изученной. Наибольшее число работ посвящено кавеолину-1. Он может играть двоякую роль в процессе опухолевой трансформации клеток и выступать в качестве как опухолевого супрессора, так и онкогена [9].
О роли других рафт-образующих белков, например белков семейства флотиллинов, и их участии в процессах канцерогенеза известно значи-
тельно меньше. Показано, что повышение уровня флотиллина-1 в образцах рака молочной железы коррелирует с клинико-морфологическими показателями и рассматривается в качестве независимого фактора неблагоприятного прогноза заболевания [10]. Кроме того, подавление экспрессии флотиллина-1 в клеточных линиях рака молочной железы приводит к уменьшению их ту-морогенности in vivo и снижению скорости пролиферации in vitro [10]. Флотиллин-1 оказывает митогенное влияние на клетки аденокарциномы предстательной железы человека. Отмечено, что во время S-фазы клеточного цикла экспрессия флотиллина-1 достигает своего пика, и белок транспортируется из плазматической мембраны в ядро [11]. Митогенное действие флотиллина-1 может быть связано с его способностью взаимодействовать с киназой Aurora B и изменять ее активность, необходимую для правильного формирования метафазной пластинки и расхождения хромосом во время митоза [12]. Подавление экспрессии флотиллина-1 приводит к уменьшению количества и активности киназы Aurora B, в результате чего нарушается процесс деления, появляются многоядерные клетки и клетки с несколькими веретенами деления. При этом значительно снижается скорость пролиферации клеток [12].
Экспрессия флотиллина-2 также может изменяться при опухолевой трансформации клеток. Известно, что уровень флотиллина-2 повышается в злокачественных новообразованиях кожи и в метастазах, коррелирует со стадией опухолевой прогрессии [13]. Флотиллин-2 увеличивает скорость пролиферации клеток в отсутствие факторов роста и усиливает инвазию клеток через мат-ригель. Суперэкспрессия флотиллина-2 в линиях меланомы человека с низким туморогенным и метастазирующим потенциалом резко увеличивает их туморогенность и способность к метаста-зированию на модели иммунокомпетентных мышей. При этом наблюдается увеличение густоты кровеносных сосудов в формируемых опухолях
[13]. Однако механизмы действия флотиллина-2 на клетки меланомы, а также его роль при возникновении злокачественных новообразований иного происхождения на сегодняшний день остаются неизученными.
Данная работа посвящена изучению роли фло-тиллина-2 при возникновении и прогрессии рака легкого (РЛ), одного из самых распространенных, неблагоприятно протекающих и сложно поддающихся лечению онкологических заболеваний
[14]. На сегодняшний день степень дифференци-ровки и статус метастазирования являются важнейшими факторами прогноза при РЛ. Однако поиск дополнительных прогностических факторов и, в первую очередь, молекулярных маркеров представляет собой одну из наиболее актуальных проблем современной молекулярной онкологии.
Primer F (29-47) Primer R (1422-1441)
Sh1-Flot-2 Sh2-Flot-2 (590-611) (1279-1300)
Рис. 1. Схема мРНК флотиллина-2. Указаны кодирующая область (CDS, coding sequence), участки мРНК, на которые отжигаются праймеры, использованные для клонирования гена (праймер F и праймер R), и мишени мшРНК (Sh1-Flot—2 и Sh2-Flot-2). В скобках приведены номера нуклеотидов.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
Клинические образцы и клеточные линии. Работа выполнена на операционном материале, полученном от 20 больных, проходивших лечение в ФГБУ "Российский онкологический научный центр" (РОНЦ) им. Н.Н. Блохина РАМН с 2005 по 2007 г. Анализируемая панель состояла из 20 образцов АК легкого с различной степенью дифференцировки и статусом метастазирования и образцов условно нормальной ткани легкого, полученных от тех же больных (пары норма/опухоль). Весь материал проходил двойную гистологическую верификацию согласно последней классификации ВОЗ (Histological Typing of Lung and Pleural Tumors третьего пересмотра, IARC Press, Lion, 2004) в отделе пат
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.