ДОКЛАДЫ АКАДЕМИИ НАУК, 2015, том 464, № 4, с. 494-497
БИОХИМИЯ, БИОФИЗИКА, МОЛЕКУЛЯРНАЯ БИОЛОГИЯ
УДК 577.175.82
ИЗМЕНЕНИЕ КОНЦЕНТРАЦИИ КАТЕХОЛАМИНОВ В КРОВИ В УСЛОВИЯХ ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫХ МОДЕЛЕЙ БОЛЕЗНИ ПАРКИНСОНА КАК БИОМАРКЁР РАННЕЙ СТАДИИ ЗАБОЛЕВАНИЯ
© 2015 г. А. Р. Ким, академик РАН М. В. Угрюмов
Поступило 15.06.2015 г.
Работа посвящена анализу в плазме крови мышей изменения концентрации катехоламинов как потенциального биомаркёра болезни Паркинсона (БП) в условиях экспериментальной модели БП, индуцированной введением 1-метил-4-фенил-1,2,3,6-тетрагидропиридина. В условиях модели до-симптомной стадии БП происходит существенное снижение уровня дофамина и Ь-ДОФА, вследствие нарушения синтеза катехоламинов. В условиях модели ранней клинической стадии БП снижается уровень Ь-ДОФА и диоксифенилуксусной кислоты, что согласуется с данными анализов крови у неле-ченных больных.
DOI: 10.7868/S0869565215280233
В последние годы показано, что многие ней-родегенеративные заболевания — болезнь Паркинсона (БП), болезнь Альцгеймера и др. — являются полигенными, системными и долгое время развиваются без проявления специфических симптомов за счет высокой нейропластичности [1]. Характерная симптоматика появляется после разрушения соответствующей регуляторной системы мозга и исчерпания его компенсаторных возможностей, что объясняет низкую эффективность лечения и ставит задачу разработки доклинической диагностики и превентивной нейро-протекторной терапии [1].
Одним из тяжелейших нейродегенеративных заболеваний является БП, характеризующаяся гибелью дофаминергических нейронов нигро-стриатной системы мозга, ответственных за регуляцию моторной функции. Также существует большое количество данных о немоторных проявлениях БП: нарушение обоняния, сна, желудочно-кишечных и сердечно-сосудистых расстройствах и т.д., что подтверждает представления о развитии патологических процессов как в центральной, так и в периферической нервной системе [2]. Более того, при БП нейродегенера-тивный процесс в ряде отделов мозга и в периферической нервной системе предшествует гибели нигростриатных дофаминергических нейронов [2, 3], что влечет за собой возникновение немоторной симптоматики задолго до нарушения дви-
Институт биологии развития им. Н.К. Кольцова Российской Академии наук, Москва E-mail: alexandrrkim@gmail.com
гательной функции, т.е. на досимптомной (доклинической) стадии.
Изучение немоторных проявлений БП является важным с точки зрения поиска периферических биомаркёров досимптомной стадии БП, что позволит в дальнейшем создать новую технологию диагностики ранних стадий болезни до появления специфических симптомов и разработать превентивную нейропротекторную терапию. Однако выявление периферических биомаркёров возможно пока только у больных уже на ранней клинической стадии и до начала специфического лечения [3]. При этом нет гарантии того, что биомаркёры, выявленные на ранней клинической стадии, также характерны и для досимптомной стадии. Поэтому важное значение приобретают параллельные исследования на экспериментальных моделях БП, в первую очередь, на моделях досимптомной и ранней клинической стадий, недавно созданных нами на мышах при подкожном введении 1-метил-4-фенил-1,2,3,6-тетрагидро-пиридина (МФТП) — предшественника специфического нейротоксина катехоламинергических нейронов. Эти модели воспроизводят системный характер нейродегенеративного процесса, характерного для больных [4].
Целью настоящей работы была экспериментальная проверка нашей гипотезы о том, что на ранней (досимптомной) стадии БП происходит изменение концентрации катехоламинов и их метаболитов в плазме крови, которое отражает системные процессы нейродегенерации и нейро-пластичности. Предполагалось также сравнить изменения концентрации катехоламинов и их ме-
таболитов в крови у животных на моделях до-симптомной и ранней клинической стадии БП.
Работа проведена на мышах-самцах линии C57BL/6N (возраст 2—2.5 мес., масса тела 22—26 г), которых получали из питомника "Пущино". Модель досимптомной стадии БП воспроизводили двукратным подкожным введением мышам МФТП ("Sigma", США) по 8 мг/кг (суммарная доза составляла 16 мг/кг), модель ранней клинической стадии БП — четырехкратным введением МФТП в дозе 10 мг/кг (суммарная доза 40 мг/кг). В обоих случаях интервал между инъекциями составлял 2 ч. Контрольным животным вводили 0.9% NaCl по аналогичной схеме. Указанные дозы МФТП незначительно отличались от тех, что были использованы нами ранее [5] для мышей из питомника "Столбовая". Как известно, мыши одной и той же линии, полученные из разных питомников, обладают разной чувствительностью к МФТП [6]. Используемые в данной работе модели, охарактеризованные по основным поведенческим, биохимическим и морфологическим показателям, полностью соответствуют ранее описанным [5].
Через 2 нед. животных декапитировали с предварительной дислокацией шейных позвонков и собирали кровь в пробирки, в которые предварительно добавляли 30 мкл 5% ЭДТА ("Sigma") и 10 мкл 10% метабисульфита натрия ("Sigma") на каждые 300 мкл крови. Далее кровь центрифугировали в течение 10 мин при 400 g и 4°C, к полученной плазме добавляли в качестве внутреннего стандарта раствор 3,4-дигидроксибензиламина ("Sigma") до конечной концентрации 250 пмоль/мл, после чего еще раз центрифугировали в течение 10 мин при 2000 g и 4°C, полученный супернатант замораживали в жидком азоте и хранили при —70°C последующего измерения катехоламинов.
Катехоламины плазмы крови осаждали с помощью оксида алюминия согласно описанной методике [7], после чего измеряли их концентрацию методом обращенно-фазовой высокоэффективной жидкостной хроматографии с электрохимической детекцией на хроматографе LC-20ADsp ("Shimadzu", Япония) с детектором Decade II ("Antec", Нидерланды). Разделение фракций проводили на колонке Reprosil-Pur C18 (Dr. Maisch, Германия), 4 х 100 мм, 3 мкм, в подвижной фазе следующего состава: 0.1 М цитратно-фосфатный буфер, 0.3 мМ октансульфат натрия, 0.1 мМ ЭДТА и 8% ацетонитрил (все реактивы "Sigma"), pH 2.2. Потенциал стеклоуглеродного электрода был равен +0.85 В, скорость потока — 1 мл/мин, температура колонки — 30°С.
Концентрацию адреналина, норадреналина, дофамина, 3,4-диоксифенилаланина (L-ДОФА) и диоксифенилуксусной кислоты (ДОФУК) рассчитывали по площади хроматографических пиков методом внутреннего стандарта. Статистиче-
|%
я
о м
S100
Я
я
св
Я
(U
Я Я
о
а
□ Контроль ■ МФТП 2 X 8
НА
А
ДА L-ДОФА ДОФУК
Рис. 1. Концентрация норадреналина (НА), адреналина (А), дофамина (ДА), 3,4-диоксифенилаланина (L-ДОФА) и диоксифенилуксусной кислоты (ДОФУК) в плазме крови у мышей через 2 нед. после двукратного введения МФТП в дозе 8 мг/кг (модель досимптомной стадии БП). Здесь и на рис. 2 * — p < 0.05 по сравнению с контролем, n = 9 в каждой группе.
ский анализ полученных результатов проводили с помощью критерия t Стьюдента, вычисляемого с использованием программного пакета Prism 5 ("GraphPad Software", США), Результаты представляли в виде M ± т. Достоверными считали различия приp < 0.05.
В условиях модели досимптомной стадии БП мы не обнаружили изменений концентрации адреналина и норадреналина в плазме крови (рис. 1). Отсутствие изменения концентрации адреналина можно объяснить тем, что основным источником его в крови являются надпочечники [8], которые не подвержены токсическому действию МФТП [9]. Сложнее объяснить отсутствие изменения уровня норадреналина в крови при деградации под действием МФТП симпатической нервной системы [4] — важнейшего источника норадреналина [8]. Тем не менее нужно учитывать, что симпатическая нервная система — не единственный продуцент норадреналина, и уровень последнего в крови зависит от многих факторов [8], в том числе и от способа получения образца крови [6]. Несмотря на то, что использованная нами дислокация шейных позвонков обладает минимальным стрессирующим воздействием, даже в этом случае не исключен массированный выброс норадрена-лина в кровь из надпочечников, который может нивелировать незначительное снижение его уровня в крови в результате деградации симпатической нервной системы.
Важнейшей характеристикой модели досимп-томной стадии БП, обнаруженной в нашей работе, является снижение концентрации дофамина в крови на 50% (рис. 1). В норме дофамин поступает в кровь из периферических источников — симпатических нейронов [8], надпочечников [10] и железистых клеток ряда периферических органов, в основном кишечника [8]. При паркинсо-
0
496
КИМ, УГРЮМОВ
!% я о м
100
Я
се
Я о Я Я
о
а
□ Контроль ■ МФТП 4 X 10
НА А ДА Ь-ДОФА ДОФУК
Рис. 2. Концентрация норадреналина (НА), адреналина (А), дофамина (ДА), 3,4-диоксифенилаланина (Ь-ДОФА) и диоксифенилуксусной кислоты (ДОФУК) в плазме крови у мышей через 2 нед. после четырехкратного введения МФТП в дозе 10 мг/кг (модель ранней клинической стадии БП).
низме также возможно поступление дофамина в кровь из мозга, поскольку и у больных БП, и у животных при действии МФТП повышена проницаемость гематоэнцефалического барьера [11]. Другими словами, уровень дофамина в крови в норме определяется функциональным состоянием периферических источников дофамина, а при БП — также и уровнем метаболизма дофамина в мозге. Отсюда следует, что снижение уровня дофамина в крови на модели досимптомной стадии БП является показателем того, что снижение поступления дофамина из периферических источников [4] существенно превышает его проникновение в кровь из мозга.
Концентрация Ь-ДОФА в крови на модели досимптомной стадии БП снижается на 40% по сравнению с контролем (рис. 1). Ь-ДОФА является непосредственным предшественником синтеза дофамина и попадает в кровь из тех же периферических источников: надпочечников [10], норадренергических нейронов симпатической нервной системы [8] и клеток желудочно-кишечного тракта [8]. Кроме того, Ь-ДОФА проходит через гематоэнцефалический барьер и может поступать в кровь из дофаминергических нейронов и, в большей степени, из моноферментных нейронов, содержащих только первый фермент синтеза дофамина — тирозингидроксилазу, — и синтезир
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.