МИКРОБИОЛОГИЯ
УДК 579.222:577.23
ИЗМЕНЕНИЕ КОНЦЕНТРАЦИИ ВНУТРИКЛЕТОЧНОГО АТФ ПРИ АДГЕЗИИ КЛЕТОК Rhodococcus ruber gt1 И Pseudomonas fluorescens C2
НА УГЛЕРОДНЫХ НОСИТЕЛЯХ
© 2014 г. Ю. Г. Максимова*, В. А. Демаков*, **
*Институт экологии и генетики микроорганизмов УрО РАН, 614081 Пермь, ул. Голева, 13 **Пермский государственный национальный исследовательский университет, 614990 Пермь, ул. Букирева, 15
E-mail: maks@iegm.ru Поступила в редакцию 23.12.2013 г.
Изучено влияние адгезии клеток нитрилутилизирующих бактерий Rhodococcus ruber gt1 и Pseudomonas fluorescens C2 на содержание внутриклеточного АТФ сразу после адсорбции и через 2 и 24—48 ч после перенесения адгезированных на углеродных носителях клеток в свежую питательную среду. Показано, что адгезия приводит к уменьшению концентрации АТФ в клетке на порядок и более, продолжающемуся в первые часы в свежей питательной среде, что может быть обусловлено энергетическими затратами на инициацию образования биопленки. Отмечено, что в суточных и двухсуточных биопленках происходит постепенное нарастание количества АТФ, рассчитанного на 1 мг адсорбированных клеток, что подтверждает их жизнеспособность.
DOI: 10.7868/S0002332914050075
Образование биопленок — одна из основных стратегий выживания микроорганизмов в окружающей среде и организме человека. Способ существования бактерий в виде биопленок создает большие проблемы в медицинской практике, так как в этом случае микроорганизмы защищены от действия антибиотиков, фагоцитов и биоцидов экзополисахаридным матриксом (Бухарин и др., 2005). В то же время следует отметить, что способность к биопленкообразованию у микроорганизмов в процессе биологической очистки сточных вод и загрязненных почв имеет положительное значение, обусловленное их повышенной устойчивостью к неблагоприятным воздействиям факторов окружающей среды (Плакунов, Николаев, 2008). В последние годы уделяется внимание возможности использования биопленок микроорганизмов в биокатализе и биотрансформации (Rosche et al., 2009; Halan et al., 2012). Поэтому всестороннее изучение процесса биопленкообра-зования важно как с общенаучной, так и с прикладной (медицинской и технологической) точек зрения.
Первый этап образования биопленки представляет собой адгезию микробных клеток к абиотической или биотической поверхностям. В формировании биопленок важны изменения в метаболизме бактерий в процессе их перехода от планктонного образа жизни к прикрепленному (Ильина и др., 2004). Понимание этого вопроса связано с углубленным изучением физиологии
мутантов бактерий, у которых нарушен процесс инициации и развития биопленок, микроскопическим наблюдением, анализом мРНК и про-теомным анализом (Ghannoum, O'Toole, 2004; Junter, Jouenne, 2004). Вместе с тем в научной литературе не было обнаружено сведений об исследовании влияния адгезии бактериальных клеток на содержание в них АТФ, тогда как изменение энергетического баланса клетки на стадии инициации образования биопленки требует детального изучения.
Определение концентрации АТФ биолюминесцентным методом основано на реакции окисления D-люциферина люциферазой светляков, которое происходит в присутствии АТФ и сопровождается пропорциональным по интенсивности выделением света (Романова и др., 1997; Ефре-менко и др., 2005). Определение внутриклеточного пула АТФ таким способом нацелено главным образом на подсчет жизнеспособных клеток и основывается на том факте, что среднее значение удельной концентрации АТФ в расчете на одну клетку определенного типа постоянно (Ludwicka et al, 1985; Efremenko et al, 2005). Определение численности клеток биолюминесцентным методом особенно актуально, если клетки находятся в прикрепленном состоянии или растут в виде биопленки (Andrews et al., 2001; Lehocky et al., 2009). Подобная методика подсчета клеток микроорганизмов не является абсолютно точной, так как количество АТФ в жизнеспособной клетке ва-
рьирует в зависимости от физиологического состояния и фазы роста. Изменение концентрации АТФ в клетке (как возрастание в результате разобщения энергетического и конструктивного обмена, так и уменьшение) свидетельствует о стрессовом состоянии микробной клетки (Ткаченко и др., 1993, 1998). Поэтому данная методика может быть также применима к определению энергетического состояния прикрепленной клетки при известном числе клеток в образце.
Благодаря уникальным свойствам ферментов метаболизма нитрилов (нитрилгидратаз (КФ 4.2.1.84), амидаз (КФ 3.5.1.4) и нитрилаз (КФ 3.5.5.1)), их способности трансформировать нит-рильные соединения в соответствующие амиды и карбоновые кислоты с высокой степенью хемо- и энантиоселективности нитрилутилизирующие бактерии несколько десятилетий являются объектом повышенного внимания (Дебабов, Яненко, 2011). Гетерогенные процессы гидролиза нитрилов, имеющие большое практическое значение, предполагают использование бактериальных клеток, иммобилизованных в структуре матрицы геля либо на поверхности нерастворимого носителя. Адсорбционная иммобилизация — модель природного адгезированного состояния клеток, и изучение физиологических свойств прикрепленных бактерий имеет как практический, касающийся изменений ферментативных активностей клеток в биокаталитических процессах, так и теоретический интерес.
Цель работы — изучение изменения концентрации внутриклеточного АТФ при адгезии клеток штаммов нитрилутилизирующих бактерий на углеродных носителях.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
Штаммы Rhodococcus ruber gt1 (ИЭГМ 612, Региональная профилированная коллекция алка-нотрофных микроорганизмов, акроним ИЭГМ, www.iegm.ru/iegmcol/index.html) и Pseudomonas fluorescens C2 (ВКМ В-2597Д) были изолированы из антропогенно загрязненных почв и селекционированы в лаборатории молекулярной микробиологии и биотехнологии ИЭГМ. R. rubergt1 обладает высокой нитрилгидратазной активностью и с помощью фермента нитрилгидратазы (КФ 4.2.1.84) трансформирует нитрилы в соответствующие амиды. Клетки штамма P. fluorescens C2 содержат нитрилазу (КФ 3.5.5.1), осуществляющую прямой гидролиз нитрилов до соответствующих карбоновых кислот.
Штаммы выращивали на синтетической минеральной среде (KH2PO4 - 1.0, K2HPO4 ■ 3H2O -1.6, NaCl - 0.5, MgSO4 ■ 7H2O - 0.5, CaCl2 - 0.005, FeSO4 ■ 7H2O - 0.01, CoCl2 ■ 6H2O - 0.01 г/л) при pH 7.4 и 30°С на шейкере GFL 3031 (GFL, Герма-
ния) со скоростью перемешивания 100 об./мин. Источником углерода для обоих штаммов была 0.1%-ная глюкоза, источником азота для штамма R. ruber gt1 — 0.05%-ный хлорид аммония, для штамма P. fluorescens C2 — 0.5%-ный ацетонитрил.
Для адсорбции клеток были использованы уг-леродсодержащие адсорбенты: березовый активный уголь (БАУ) (ООО "УралХимСорб", Пермь), Сибунит (Институт катализа СО РАН, Новосибирск), "Сапропель" (Институт проблем переработки углеводородов СО РАН, Омск) и карбонизированные углеродные волокна Урал ТМ-4 ("Химволокно", Беларусь). Размер частиц БАУ составлял 2—4 мм, диаметр макропор — 5—40 мкм. Носитель марки Сибунит был получен путем высокотемпературной карбонизации аморфного углерода (сажи); диаметр частиц 2 мм. Носитель "Сапропель" был получен карбонизацией илистых отложений пресных озер Омской обл., диаметр частиц составлял 2—3 мм, диаметр макропор — 4—5мкм. Клетки адсорбировали на углеродных материалах в течение 2 ч при 22° С с перемешиванием на шейкере при 120 об./мин. Массу клеток в 1 мл суспензии определяли взвешиванием на аналитических весах предварительно высушенной до постоянного значения биомассы в известном объеме суспензии. Массу адгезированных клеток, мг, определяли по формуле
А = (ОДисх - ОДфильтрУОДисх m
где ОДисх — оптическая плотность суспензии клеток до адсорбции, измеренная при длине волны 540 нм; ОДфильтр — оптическая плотность суспензии клеток после адсорбции; m — концентрация клеток в суспензии до адсорбции, мг/мл.
Для определения концентрации АТФ в клетках, находящихся в суспензии, 1 мл образца центрифугировали 5 мин при 15400 g, удаляли надосадоч-ную жидкость и разрушали клетки 1 мл 90%-ного диметилсульфоксида (ДМСО) в течение 15 мин на льду, замораживали образец и хранили при —18°С. Для определения концентрации АТФ в прикрепленных клетках к 200 мг носителя с адсорбированными клетками добавляли 2 мл ДМСО и через 15 мин экспозиции на льду жидкую фазу центрифугировали 2 мин при 14000 об./мин и замораживали надосадочную жидкость. Для определения концентрации АТФ использовали стандартный набор реактивов ATP Bioluminescent Assay Kit, (Sigma, США), образцы разводили в 10 раз и измеряли интенсивность свечения на планшетном ридере Tecan infinite M200 pro (Швейцария).
Статистическую обработку полученных результатов проводили с помощью критерия Стью-дента и пакета программ Microsoft Excel. Различия считали достоверными при уровне значимо-стиp < 0.05.
Влияние адгезии на углеродсодержащих носителях на концентрацию АТФ в клетках R. ruber gt1 и P. fluorescens C2
Марка носителя Характеристики носителей Количество АТФ, нМ/мг
Rhodococcus ruber gt1 Pseudomonas fluorescens C2
размер частиц, мм диаметр макропор, мкм суспендированные клетки адгезированные клетки суспендированные клетки адгезированные клетки
Урал ТМ-4 - 5-10* 1.071 ± 0.484 0.049 ± 0.035 0.144 ± 0.018 0.105 ± 0.044
БАУ 2-4 5-40 1.071 ± 0.484 0.020 ± 0.011 0.144 ± 0.018 0.039 ± 0.011
Сибунит 2 0.02** 1.071 ± 0.484 0.003 ± 0.001 0.144 ± 0.018 0.032 ± 0.006
"Сапропель" 2-3 4-5 1.071 ± 0.484 0.002 ± 0.001 0.144 ± 0.018 0.006 ± 0.004
Примечания. "—" — технологическая форма носителя представлена не частицами, а волокнами.
* Тканый материал, вместо диаметра макропор представлено межволоконное пространство, мкм. ** Макропоры отсутствуют, представлен диаметр мезопор.
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
Выбранные в качестве объектов изучения штаммы нитрилутилизирующих бактерий R.. ruber gt1 и P. fluorescens C2 при росте на синтетической минеральной среде способны к образованию биопленок, которые могут служить гетерогенным биокатализатором синтеза коммерчески значимых амидов и карбоновых кислот из нитрилов. Для того чтобы изучить изменение концентрации АТФ на стадии инициации развити
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.