МОЛЕКУЛЯРНАЯ БИОЛОГИЯ, 2015, том 49, № 4, с. 658-666
МОЛЕКУЛЯРНАЯ БИОЛОГИЯ КЛЕТКИ
УДК 577.218
ИЗМЕНЕНИЕ КОПИЙНОСТИ ГЕНЕТИЧЕСКИХ ЛОКУСОВ
ПРИ РАКЕ ЖЕЛУДКА © 2015 г. О. И. Кит, Д. И. Водолажский*, Д. С. Кутилин, Е. Н. Гудуева
Ростовский научно-исследовательский онкологический институт Министерства здравоохранения РФ,
Ростов-на-Дону, 344037 Поступила в редакцию 27.10.2014 г. Принята к печати 21.11.2014 г.
Изменение числа копий считается одним из основных механизмов контроля экспрессии генов, ключевых для малигнизации. Поэтому характеристика этих генов и определение точного числа их копий важны для понимания молекулярных основ возникновения и прогрессии опухолей человека, а также для выявления предиктивных маркеров малигнизации. В представленной работе методом количественной ПЦР в реальном времени определена относительная копийность 19 локусов (BAX, GSTP1, CASP3, CASP8, mFU, OCT4, C-MYC, SOX2, BCL2, CASP8/FADD, NANOG, P53, CASP9, И.-10, ШШ1, Ш2, ACTB) в опухолевых и условно здоровых тканях 25 жителей Юга России с гистологически подтвержденным диагнозом аденокарциномы С1—С2, С3 и перстневидноклеточного рака желудка. Обнаружено, что изменение копийности этих генов специфично для рака определенного гистологического типа, оно зависит также от стадии дифференцировки опухолевых клеток. Полученные данные свидетельствуют о важной роли изменения копийности генов BAX, CASP3, CASP8, OCT4, C-MYC, SOX2, BCL2, NANOG, CASP9, Ш2, ACTB, MKI67, И.-10, GSTP1 и P53 в малигнизации тканей желудка.
Ключевые слова: копийность генов, аденокарцинома, перстневидноклеточный рак, количественная РВ-ПЦР, апоптоз, пролиферация, факторы транскрипции.
CHANGES IN THE COPY NUMBER OF GENETIC LOCI IN GASTRIC CANCER, by O. I. Kit, D. I. Vodola-zhsky*, D. S. Kutilin, E. N. Gudueva (Rostov Research Institute of Oncology, Ministry of Health of the Russian Federation, Rostov-on-Don, 344037 Russia; *e-mail: dvodolazhsky@gmail.com). Changes in gene copy number is one of the basic mechanisms controlling the expression of key genes, involved in processes of malignancy. Accurate identification and characterization of relative copy number is important for understanding of the molecular basis of human carcinogenesis and search for predictive markers of malignancy. Using Real-Time qPCR (RT-qPCR) we determined the relative copy number of 19 loci (BAX, GSTP1, CASP3, CASP8, HIF1A, OCT4, C-MYC, SOX2, BCL2, CASP8/FADD, NANOG, P53, CASP9, IL-10, NFKB1, HV2, ACTB) in tissues (tumor and relatively healthy) of 25 patients of South Russia with histologically confirmed diagnosis of stomach cancer: adenocarcinoma G1-G2, G3 and signet ring cell carcinoma. It was found that changes in the gene copy number were specific to histological type of cancer and depended on the stage of tumor cell differentiation. All this suggests that the changes in copy number of BAX, CASP3, CASP8, OCT4, C-MYC, SOX2, BCL2, NANOG, CASP9, NFKB1, HV2, ACTB, MKI67, IL-10, GSTP1 and P53 play an important role in gastric carcinogenesis.
Keywords: gene copy number, gastric adenocarcinoma, signet ring cell carcinoma, real-time qPCR, apoptosis, proliferation, transcription factors.
DOI: 10.7868/S0026898415040096
По данным ВОЗ, рак желудка занимает четвертое место в мире среди злокачественных новообразований у мужчин и пятое — у женщин. Это заболевание имеет высокий показатель смертности — более 464000 мужчин и 273000 женщин в год [1]. В России рак желудка по распространенности занимает седьмое место среди онкологических заболеваний (94.8 случаев на 100000 населения), однако
* Эл. почта: dvodolazhsky@gmail.com
характеризуется высокой летальностью — 51.2% больных умирают в течение года с момента установления диагноза [2].
Малигнизированные клетки получают возможность выживать в организме за счет изменения сигнальных путей, которые обеспечивают проведение автономных сигналов к росту; нечувствительности к сигналам, ингибирующим рост; устойчивости к проапоптотическим сигналам; неограниченного пролиферативного потенциала;
способности поддерживать ангиогенез, а также способности к инвазии и метастазированию. Молекулярные изменения, ответственные за приобретение этих свойств, могут служить онкомарке-рами [3].
Изучение механизмов канцерогенеза необходимо для разработки новых терапевтических подходов и поиска потенциальных молекулярных маркеров, пригодных для ранней диагностики и/или прогнозирования течения заболевания. Известно, что в основе развития рака желудка кишечного и диффузного гистологического типа лежат различные моле-кулярно-генетические события [4].
События, происходящие в клетках при развитии как интестинального, так и диффузного типов рака желудка, включают в себя мутации в ге-нах-супрессорах опухолевого роста (в частности, Р53), потерю гетерозиготности, геномную нестабильность и ряд других общих изменений. При раке желудка обоих гистологических типов выявляется целый ряд нарушений в CDKN2A, GSTP1, APC, MGMT, MLH1, DAPK, THBS-1, RUNX3и других генах, которые можно рассматривать как потенциальные молекулярные маркеры рака желудка, тем более что некоторые из них появляются уже на ранних стадиях онкогенеза [5].
В 2004 г. был описан еще один источник изменчивости генома — вариации числа копий (Copy Number Variation, CNV) [6]. Одним из механизмов, посредством которого геномные перестройки могут влиять на фенотип клетки, считается изменение числа копий генов и важных регу-ляторных элементов. Геномные нарушения в процессе малигнизации тканей часто возникают спорадически. Частоты локусспецифичных мутаций, приводящих к геномным перестройкам, составляют 10-4 —10-5, что в 1000—10000 раз превышает частоту спорадических SNP-мутаций [7], поэтому изменения копийности генетических ло-кусов могут служить информативными и чувствительными маркерами малигнизации тканей.
Изменение числа копий считается одним из основных механизмов контроля экспрессии генов, ключевых для выживания и малигнизации клетки. CNV — генетический полиморфизм, обусловленный несбалансированными хромосомными перестройками, такими как делеции и дупликации, при котором число копий определенного гена может снизиться или увеличиться, и, следовательно, изменится (понизится или повысится) экспрессия продукта этого гена — кодирующей или некодирующей РНК [8]. CNV способствуют развитию и прогрессии злокачественных новообразований у человека, они представляют собой один из основных механизмов контроля экспрессии потенциальных онкогенов и генов-супрессоров в опухолевых клетках [9].
Предполагается, что значение СЫУ в качестве фактора малигнизации тканей ранее недооценивали [10]. В частности, мутации онкогенов при раке желудка включают амплификации, которые обнаруживаются в хромосомном локусе 17д21, кодирующем рецептор эпидермального фактора роста HER-2, TOP2A и DARPP32. Увеличение числа копий гена С-MYC отмечено в 51.5% образцов опухолей желудка, при этом в 21.2% случаев наблюдается потеря одной копии гена P53. Экспрессия мРНК гена С-MYC в опухолях значительно выше, чем в нормальной ткани, а мРНК гена P53, наоборот, существенно ниже. Изучение амплификации гена MDM2 при раке желудка выявило корреляцию между увеличением копийности этого гена, повышением экспрессии гена MDM2 и снижением — P53 [11]. Ген MDM2, локализованный на хромосоме 12, считается негативным регулятором функции белка Р53. Путь MDM2/P53 рассматривается как важный составной компонент канцерогенеза. Только около 20% случаев рака желудка не связаны с изменением копийности генов MDM2 и P53 [11]. В результате изучения роли фактора транскрипции ОСТ4 в канцерогенезе желудка установлено, что экспрессия гена OCT4 в опухолевой ткани выше, чем в прилегающих условно здоровых тканях, тканях атрофического гастрита и язвы желудка, при том что экспрессия ОСТ4 изменяется совместно с экспрессией генов SOX2, NANOG и С-MYC [12, 13].
Обнаружено, что при раке желудка изменена копийность генов, локализованных в в ряде хромосомных регионов: увеличена в 5р, 8д, 20р, 20д и снижена в 4д, 9р,18д, 21д. Причем наиболее значительной амплификации подвержены области 20д12, 20д12-20д13.1, 20д13.1-20д13.2 и 20д13.2-20д13.3, а наиболее часто делетируется 9р21 [14]. Эти СЫУ часто затрагивают большую группу генов, расположенных близко друг к другу на одной хромосоме [9]. Увеличение или уменьшение числа копий ДНК происходит не случайно, а скорее представляет собой результат комплексных генетических событий, происходящих в ходе канцерогенеза. Идентификация генов, которые как ам-плифицируются и сверхэкспрессируются, так и генов, которые могут подвергаться частичным делециям и снижению экспрессии, очень важна, потому что эти гены можно, по-видимому, рассматривать как точку инициации генетических изменений.
Точное знание числа копий генов и характеристика этих генов важны для понимания молекулярных основ канцерогенеза. А клиническая значимость определяется возможностью обнаружения предиктивных маркеров малигнизации, амплифи-каций или делеций онкогенов, которые можно корректировать с помощью таргетных препаратов. Поэтому целью нашей работы стало изучение механизмов малигнизации тканей желудка на примере
изменения относительной копийности генетических локусов, ответственных за апоптоз, онкоге-нез, пролиферацию и окислительное фосфорили-рование.
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ
Исследовали образцы тканей желудка (опухолевых и условно нормальных) 25 жителей Юга России с гистологически подтвержденным диагнозом рак желудка: 15 образцов аденокарцино-мы G1—G2, пять — G3 и пять — перстневиднокле-точного рака, полученных в ходе хирургического вмешательства в Ростовском научно-исследовательском онкологическом институте (РНИОИ) с 2013 по 2014 гг. Все больные, давшие добровольное информированное согласие на использование биоптатов, имели ECOG статус от 0 до 2. Образцы тканей верифицировали с помощью стандартного патолого-морфологического исследования с окрашиванием фиксированных срезов гематоксилин-эозином. После проведения патолого-морфологи-ческого исследования выделяли две группы образцов биоптатов: опухолевые (малигнизированные) и кон
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.