научная статья по теме ИЗМЕНЕНИЕ МНОЖЕСТВЕННОЙ ЛЕКАРСТВЕННОЙ УСТОЙЧИВОСТИ И ЧУВСТВИТЕЛЬНОСТИ ЛЕЙКОЗНЫХ КЛЕТОК К ОКИСЛИТЕЛЬНОМУ СТРЕССУ В БОЛЬШИХ ОПУХОЛЯХ Биология

Текст научной статьи на тему «ИЗМЕНЕНИЕ МНОЖЕСТВЕННОЙ ЛЕКАРСТВЕННОЙ УСТОЙЧИВОСТИ И ЧУВСТВИТЕЛЬНОСТИ ЛЕЙКОЗНЫХ КЛЕТОК К ОКИСЛИТЕЛЬНОМУ СТРЕССУ В БОЛЬШИХ ОПУХОЛЯХ»

УДК 576.385.5:576.314

ИЗМЕНЕНИЕ МНОЖЕСТВЕННОЙ ЛЕКАРСТВЕННОЙ УСТОЙЧИВОСТИ И ЧУВСТВИТЕЛЬНОСТИ ЛЕЙКОЗНЫХ КЛЕТОК К ОКИСЛИТЕЛЬНОМУ

СТРЕССУ В БОЛЬШИХ ОПУХОЛЯХ

© 2010 г. В. В. Шапошникова, А. Ф. Корыстова, М. О. Емельянов, М. Х. Левитман, Ю. А. Ким*, Ю. Н. Корыстов

Институт теоретической и экспериментальной биофизики РАН, 142290, Пущино Московской области;

электронная почта:ykorystov@rambler.ru *Институт биофизики клетки РАН, 142290, Пущино Московской области Поступила в редакцию 24.02.2010 г.

Исследовали возможность изменения устойчивого к винкристину штамма лейкозных клеток Р388 (Р388ВР) при длительной перевивке опухоли. Клетки Р388ВР перевивали на мышах ДВА2 из малых (5 дней) и больших (7—8 дней) опухолей. Множественную лекарственную устойчивость оценивали по чувствительности клеток к винкристину и транспорту из клеток эфира кальцеина. Также определяли чувствительность клеток к окислительному стрессу по их выживаемости и количество активных форм кислорода в клетках по окислению дихлордигидрофлуоресцеина. При перевивке малых опухолей свойства штамма не менялись. Примерно через полгода перевивки из больших опухолей штамм Р388ВР изменялся, что проявлялось загрязнением опухолей эритроцитами, увеличением скорости транспорта из клеток эфира кальцеина, повышением устойчивости к винкристину и чувствительности к окислительному стрессу. Изменения штамма сохранялись при последующих перевивках опухоли и, возможно, связаны с мутацией, приводящей к конститутивной активации ШБ-системы. Возможность изменения лейкозных клеток при перевивке больших опухолей необходимо учитывать при работе с линиями опухолевых клеток.

Ключевые слова: активные формы кислорода, винкристин, лейкозные клетки, множественная лекарственная устойчивость, перекись водорода.

Хорошо известно, что свойства спонтанных и индуцированных опухолей изменяются по мере их роста в организме животных и человека. Это может происходить в результате как активации транскрипции генов, например генов, индуцируемых гипоксией [1], так и замещения исходных опухолевых клеток клетками с мутациями, дающими им селективное преимущество для выживания в опухоли. Показано, [2], что множественная лекарственная устойчивость (МЛУ) штамма лимфолейкозных клеток Р388ВР (устойчивый к винкристину штамм) снижена в первые сутки после прививки и возрастает при увеличении времени после прививки. Изменение МЛУ опухолевых клеток при перевивке и по мере роста опухоли объясняли подавлением МЛУ активными формами кислорода (АФК). Опухолевые клетки образуют АФК, количество которых зависит от содержания кислорода в опухоли. Концентрация кислорода и количество АФК в опухолевых клетках

Сокращения: АФК — активные формы кислорода, ДХФ — 2',7'-дихлорфлуоресцеин, ДХФН2 — 2',7'-дихлордигидро-флуоресцеин, МЛУ — множественная лекарственная устойчивость.

максимальны сразу после перевивки опухоли и снижаются при увеличении гипоксии и количества клеток в опухоли [3]. Обнаруженная вариабельность МЛУ опухолевых клеток отражает реакцию на условия в опухоли (изменение концентрации кислорода) и не может рассматриваться как устойчивая трансформация клеток, поскольку цикл снижения и увеличения МЛУ повторяется после каждой перевивки опухоли в тех же пределах. Это означает, что свойства клеток остаются постоянными. Однако при длительном пребывании клеток в условиях гипоксии, возникающей в больших опухолях, селективное преимущество имеют клетки с мутациями, способствующими выживанию в этих условиях. И если эти условия существуют (или повторяются) длительное время, то му-тантные клетки могут заместить исходные.

В настоящей работе изучена возможность устойчивой модификации штамма опухолевых клеток при длительном перевивании их из заведомо больших гипоксических опухолей. Обнаружено изменение клеток Р388ВР при перевивках из больших опухолей (2 млн. клеток на мышь из опухолей, росших в течение 7—8 сут), которое

проявляется контаминацией опухолей эритроцитами, увеличением транспорта из клеток эфира кальцеина, повышением устойчивости к винкри-стину и чувствительности к окислительному стрессу.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

В работе использовали следующие материалы. Раствор Хенкса с добавлением 20 мМ HEPES, среда RPMI-1640, модифицированная 20 мМ HEPES и Z-глутамина без бикарбоната, эмбриональная телячья сыворотка, гентамицин, трипа-новый синий, дигитонин, ингибитор транспортных белков циклоспорин А, ацетоксиметиловый эфир кальцеина и диацетат 2',7'-дихлордигидро-флуоресцеина (ДХФН2-ДА, Sigma, США). Перекись водорода (3%) — аптечный препарат; противоопухолевый препарат винкристин (Gedeon Richter, Венгрия). Матричный раствор ацетокси-метилового эфира кальцеина (2 мМ) готовили в диметилсульфоксиде, а исходные растворы ДХФН2-ДА (10 мМ) и циклоспорина А — в этаноле. Винкристин (3.3 мМ) растворяли в физиологическом растворе с добавкой 0.9% бензилового спирта. Все матричные растворы хранили при -20°С.

Клетки лимфолейкоза Р388 выращивали в брюшной полости 8—10 недельных самцов мышей ДВА2 (коллекция животных Института биоорганической химии РАН, Пущино). Мышей содержали по 20 особей в клетке (35 х 25 х 15 см) при температуре 22 ± 2°С, 12 ч световом цикле и свободном доступе к пище и воде. Эксперименты одобрены Этическим комитетом Института теоретической и экспериментальной биофизики РАН. Устойчивые к винкристину клетки Р388 получены путем обработки мышей с опухолями винкристином (1 мкг/кг). Винкристин вводили в брюшную полость через день после прививки опухолевых клеток (2 х 106 клеток на мышь). После увеличения числа клеток в брюшной полости (через 7 сут после прививки) их перевивали и через сутки повторно вводили 1 мг/кг винкристина. Эту процедуру повторяли 6 раз. В результате получили линию клеток Р388ВР, устойчивую к винкристину. После получения штамма Р388ВР опухоли перевивали двумя способами: по 0.5 х 106 клеток из пятидневных опухолей на мышь и по 2 млн. клеток из 7-8-дневных опухолей на мышь. Для опытов in vitro клетки извлекали из брюшной полости мышей через 6—7 дней после прививки, центрифугировали в течение 5 мин при 700 g в 3 мл среды RPMI-1640 с добавлением 10% сыворотки, осадок помещали в такую же среду и опять центрифугировали. После последнего центрифугирова-

ния клетки помещали в раствор Хенкса с 1% сыворотки для определения активности транспортных белков или в среду ЯРМ1-1640 с 10% сыворотки для определения чувствительности клеток к винкристину или перекиси водорода. Все процедуры центрифугирования и отмывок выполняли при комнатной температуре.

Суспензия клеток Р388ВРэ содержит эритроциты, для удаления которых к осадку суспензии опухолевых клеток добавляли 6 мл 10 мМ трис-НС1, рН 7.2, содержащий 0.87% N^0, и перемешивали. Клетки выдерживали в этом растворе в течение 10 мин при 2—4°С, периодически встряхивая. По окончании инкубации клетки осаждали центрифугированием, удаляли раствор N^0 и дважды отмывали в 6 мл средой ЯРМ1-1640 с 10% сыворотки или раствором Хенкса.

Для определения выживаемости по 3 мл суспензии клеток, взятых в различной концентрации, помещали в пластиковые чашки диаметром 3 см со средой ЯРМ1-1640 с 10% сыворотки и ген-тамицином (40 мкг/мл). Через 30 мин адаптации к температуре 37°С клетки инкубировали с вин-кристином или перекисью водорода в течение 1 ч при 37°С. Затем клетки дважды отмывали от вин-кристина или перекиси водорода раствором Хенкса с 1% сыворотки и инкубировали в течение 22 ч в атмосфере 5% СО2 в среде ЯРМ1-1640 с 10% сыворотки и гентамицином (1.2—1.5 х 106 клеток/мл, по 3 мл суспензии клеток в пластиковой чашке диаметром 3 см). По окончании инкубации определяли долю мертвых клеток по окраске 0.04% раствором трипанового синего. Эффект винкристина и перекиси водорода на выживаемость клеток определяли по соотношению живых клеток в опытных вариантах (Ыа) и в контроле (Дс) через 22 ч инкубации: % = Да/Дс х 100%.

Активность транспортных белков определяли по скорости образования кальцеина из его аце-токсиметилового эфира, а МЛУ — по изменению скорости образования кальцеина в присутствии ингибитора МЛУ циклоспорина А. Этот метод был разработан нами ранее [2] на основе метода, описанного в [4]. Субстрат транспортных белков ацетоксиметиловый эфир кальцеина легко проникает в клетки. Он откачивается транспортными белками из клеток или под действием эстераз превращается в кальцеин (флуорохром), который медленно выходит из клеток. Таким образом, с увеличением активности транспортных белков скорость образования в клетках кальцеина уменьшается. Скорость образования кальцеина зависит также от концентрации клеток и ацетоксимети-лового эфира кальцеина, которые варьируют в различных пробах и опытах и, следовательно, абсолютное значение скорости не может быть ме-

рой МЛУ [2]. Количественной характеристикой МЛУ является коэффициент (K), который определяется отношением скоростей образования кальцеина в клетках с циклоспорином А (к) и без ингибитора (k): K = к/к.

В настоящей работе мы несколько модифицировали этот метод определения МЛУ [2]. Во-первых, для более точного определения низкой скорости образования кальцеина при высокой скорости транспорта ацетоксиметилового эфира кальцеина из клеток Р388ВР мы увеличили концентрацию ацетоксиметилового эфира кальцеина до 200 нМ, а число клеток до 106. Во-вторых, флуоресценцию внеклеточного кальцеина подавляли, добавляя 2 мкМ Со2+ [5]. Скорость образования кальцеина в клетках определяли с интервалом 2 с на флуориметре MF44 Perkin-Elmer в кювете, содержащей раствор Хенкса с 0.5% сыворотки (3 мл), 200 нМ ацетоксиметилового эфира кальцеина и 2 мкМ CoCl2 при постоянном перемешивании. Длины волн возбуждения и эмиссии были 493 и 515 нм соответственно. Скорость образования кальцеина без ингибитора (к) измеряли в течение нескольких минут. Затем в эту же кювету добавляли циклоспорин А (1 мкг/мл, 0.8 мкМ) для определения скорости образования кальцеина при подавлении активности транспортных белков (к) и коэффициента ингибиро-вания активного транспорта ацетоксиметилового эфира кальцеина (K).

Для определения АФК в клетках Р388ВРэ in vitro суспензию клеток делили пополам. Одну час

Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.

Показать целиком