БИОЛОГИЧЕСКИЕ МЕМБРАНЫ, 2014, том 31, № 2, с. 83-87
УДК 577
ИЗМЕНЕНИЕ МОРФОЛОГИИ И СТРУКТУРЫ ЦИТОПЛАЗМЫ НЕЙРОНА В ОТВЕТ НА ДЕЙСТВИЕ ГЛУТАМАТА И ИЗМЕНЕНИЕ ЛИПИДНОГО БИСЛОЯ ПЛАЗМАТИЧЕСКОЙ МЕМБРАНЫ
© 2014 г. Е. З. Бибинейшвили*, И. Г. Савикова, А. И. Юсипович, Л. Р. Горбачева, Г. В. Максимов
Биологический факультет Московского государственного университета им. М.В. Ломоносова,
Ленинские горы, 1, 119234, Москва *электронная почта: vedmezhonik@mail.ru Поступила в редакцию 01.05.2013 г.
С помощью лазерной интерференционной микроскопии (ЛИМ) установлено, что действие глута-мата сопровождается увеличением диаметра тела и отростка нейрона (34 и 53% соответственно), а тромбина — их уменьшением (27 и 17% соответственно) и структурными перестройками в аксоне. При последовательном воздействии на нейроны тромбина и глутамата (с интервалом 5 мин) диаметр тела, отростка и структура аксона не менялись. Изменение состава плазматической мембраны может различным образом отражаться на структуре цитоплазмы тела и аксона. Экстракция холестерина из плазматической мембраны вызывает уменьшение показателя преломления цитоплазмы тела и отростка нейрона, а встраивание лизолипидов увеличивает показатель преломления цитоплазмы тела и уменьшает показатель преломления цитоплазмы отростков.
Ключевые слова: нейроны, глутамат, тромбин, лизолецитин, метил-в-циклодекстрин.
Б01: 10.7868/80233475514010034
Известно, что состояние плазматической мембраны нейронов изменяется при серьезных патологиях [1, 2], поэтому в настоящее время активно исследуется влияние плазматической мембраны нейрона на структуру цитоплазмы (содержание органелл, оптическая плотность гиалоплазмы и других компонентов, природа вещества цитоплазмы и их концентрация) и морфологию (изменение объема, диаметра клетки, диаметра и длины отростков). Эффект, вызванный изменением на уровне липидного бислоя плазматической мембраны, интересно сравнить с эффектом медиаторов, действующих на рецепторы мембраны.
При повышении внеклеточной концентрации глутамата, который длительно удерживается в межклеточном пространстве, развиваются такие патологические состояния головного мозга, как ишемия, гипоксия, инсульт и др. Нейродеструк-тивное действие глутамата связано в основном с нарушением кальциевого обмена [3] и деполяризацией митохондрий. При активации рецепторов глутаматом увеличивается поступление Са2+ из внеклеточного пространства в цитозоль одновременно с [4, 5]. При этом наблюдается стимуляция кальций-зависимых протеиназ, фосфоли-паз (например, фосфолипазы А1) и эндонуклеаз, развивается недостаточность функций ионных
насосов [6], нарушается мембранный транспорт ионов и воды и возникает одно из ишемических повреждений головного мозга — церебральный отек, который приводит к повреждению мембраны и цитоплазмы клеток мозга [7]. Так известно, что отек астроцитов может происходить в результате увеличения потока натрия в клетку, тогда как обычно астроциты имеют очень низкую проницаемость для этих ионов [8]. Ранее нами было показано, что тромбин, ключевая сериновая проте-иназа гемостаза, обладает нейропротекторным действием в условиях эксайтотоксичности [9]. Эффект тромбина реализуется через специфический рецептор, активируемый протеиназами типа 1 (PAR1). PAR-рецепторы относятся к трансмембранным рецепторам, связанным с G-белками, они опосредуют, в частности, действие тромбина на структуру актина, изменение формы клеток и проницаемость мембраны. В настоящее время отсутствуют данные о состоянии плазматической мембраны нейронов и их морфологии при совместном действии тромбина и глутамата.
В представленной работе с помощью современного неинвазивного метода лазерной интерференционной микроскопии (ЛИМ) изучено состояние цитоплазмы и изменение морфологии
св Я О
р
« 1
<0 я <ч о
р 2 1.
m се
р
«
и
Я о Я о
.6
1.2
0.8
т 1
Я '
2
3 я
л
4
8 я
о О £0 О
Контроль Глутамат I I Тромбин \/ /\ Глутамат + тромбин
Диаметр тела
Диаметр отростка
Рис. 1. Изменения геометрических параметров нейрона, вызванные глутаматом, тромбином и совместным действием глутамата и тромбина. Здесь и на рис. 2—4 звездочкой (*) отмечено статистически значимое отличие от значений в контроле прир < 0.05.
а
§2.0 р
«
е
я
X 1.6 Рч
л Я л
5
т и с
о
£ О
1.2
0.8
0.4
Контроль Глутамат I I Тромбин CZZ Глутамат + тромбин
ОРХ тела
ОРХ отростка
воздействии на ионотропные мембранные рецепторы iGluR (к которым относятся NMDA, каи-натные и AMPA-рецепторы) и PAR-рецепторы или при изменении состояния липидного бислоя мембраны.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
Объектом исследования служила первичная культура гиппокампальных нейронов, выделенных из головного мозга 1-3-дневных крысят. Использовали физиологический раствор (мМ): 135 NaCl, 5 KCl, 2 CaCl2, 20 HEPES; 5 ¿»-глюкозы, рН 7.4, 37°С; растворы глутамата (Sigma, конечная концентрация 10-4 М), тромбина (Sigma, конечная концентрация 10-8 М), метил-ß-цикло-декстрина (МЦД) (Sigma, конечная концентрация 10-2 М), лизолецитина (Sigma, конечная концентрация 0.2%).
С помощью ЛИМ регистрировали оптическую разность хода (ОРХ) вещества цитоплазмы нейронов, которая зависит от показателя преломления и линейной толщины обьекта в точке на линии сканирования. Оценивали максимальное значение ОРХ поперечного сечения, проходящего через фазовое изображение отростка, проведенного на расстоянии 5 мкм от тела нейрона. В теле нейрона также оценивали максимальное значение ОРХ сечения, проведенного через центр тела. Изменение ОРХ зависит от перераспределения вещества цитоплазмы или органелл [13, 14]. Для сферических или цилиндрических объектов максимальное значение ОРХ в области перпендикулярного сечения пропорционально аксиальному диаметру объекта [13]. Изображения нейрона, а также профили распределения ОРХ в аксоне и теле вдоль скан-линий получали до и после добавления лизолецитина, МЦД, глутамата и тромбина. Изображения обрабатывались в программе SPIP, значения ОРХ и диаметров клетки и аксона нормировали на контроль. Статистическую значимость различий значений в контроле и опыте оценивали с помощью критерия Манна—Уитни.
Рис. 2. Изменения ОРХ нейрона, вызванные глутама-том, тромбином и совместным действием глутамата и тромбина, нормированные по значениям в контроле.
тела нейрона и аксона при действии на цитоплаз-матическую мембрану лизолецитина, метил-р-циклодекстрина (МЦД), глутамата и тромбина. Лизолецитин — лизофосфолипид, который встраивается в плазматические мембраны и инициирует формирование искривлений липидного бислоя и образование пор [10]. Известно, что инкубация мембран с МЦД приводит к экстракции из них холестерина [11, 12].
Цель работы заключалась в исследовании изменений структуры цитоплазмы нейрона при
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
Изменение морфологии и структуры цитоплазмы нейрона под действием глутамата и тромбина.
Анализ морфологических параметров гиппокам-пальных нейронов первичной культуры, выделенных из мозга новорожденных крысят, показал, что и глутамат, и тромбин влияют на определяемые показатели как по отдельности, так и совместно.
При действии глутамата наблюдалось увеличение ОРХ и диаметров сомы и отростков нейрона (рис. 1, 2). Поскольку изменения ОРХ в данном случае могут отражать увеличение объема, вызванное глутаматом, нельзя делать выводы об из-
0
ИЗМЕНЕНИЕ МОРФОЛОГИИ И СТРУКТУРЫ ЦИТОПЛАЗМЫ НЕЙРОНА
85
менениях показателя преломления цитоплазмы нейрона.
При действии тромбина диаметр и ОРХ сомы нейрона уменьшались, в то время как снижение диаметра отростков не сопровождалось изменениями их ОРХ (рис. 1, 2). Вероятно, тромбин по-разному действует на отростки нейрона и на тело клеток и вызывает увеличение показателя преломления цитоплазмы отростков.
Известно, что тромбин — это высокоспецифичная протеаза, расщепляющая одну пептидную связь во внеклеточном Оконце рецептора РАЯ1, что приводит к образованию так называемого "привязанного лиганда", взаимодействие которого со второй внеклеточной петлей активирует рецептор. Показано, что активированный тромбином РАЯ1 вызывает транзиторное высвобождение ионов кальция из саркоплазматическо-го ретикулума (через 1Р3-рецепторы), а также реорганизацию актинового цитоскелета, активацию цитоплазматической фосфолипазы А2, ЯИо-киназы, изменение высвобождения АТР и экспрессии аквапорина 4 и др. [7, 15—20]. Множественные эффекты тромбина указывают на возможность его влияния на структуру и проницаемость мембраны клеток, а также на состояние цитоплазмы. Результаты нашей работы подтверждают это предположение. Однако механизм влияния тромбина на нейроны требует дальнейшего изучения.
Ранее мы показали, что тромбин проявляет нейропротекторное действие на фоне токсических эффектов глутамата [7]. Поскольку токсические эффекты глутамата, связаны с нарушением транспорта ионов и дисфункцией митохондрий они, несомненно, будут отражаться на состоянии цитоплазмы и мембран клетки, что подтверждается представленными результатами. Мы предположили, что в данной модели тромбин способен не только предотвращать вызванную глутаматом гибель нейронов, но влиять и на другие эффекты глутамата, в частности на морфологию нейронов. Поэтому в следующей серии опытов мы оценивали совместное влияние тромбина и глутамата на параметры нейронов.
При совместном действии глутамата и тромбина (тромбином нейроны обрабатывали предварительно) не выявлено статистически значимых изменений ОРХ и геометрических размеров тела нейрона и его отростков (рис. 1, 2).
Таким образом, мы обнаружили, что тромбин способен купировать не только токсические эффекты глутамата на нейроны [7], но и его влияние на морфологию культивируемых клеток. Возможно, этот эффект связан с обнаруженной нами ранее способностью тромбина нормализовать кальциевый гомеостаз нейронов, нарушенный глутаматом [7]. Более того, влияние глутамата на
св ЕС
|1.4
о Я
§ 1.2 &
о
И 1.0
&
§0.8
о Я
§0.6
т Я
г, л
а 0.4 я
л
н 0.2 я
о о я н О
0
Контроль МБЦ
Диаметр тела
Диаметр отростка
Рис. 3. Изменения геометрических параметров нейрона, вызванные лизолецитином и МЦД.
морфологические параметры гиппокампа
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.