РОССИЙСКИЙ ИММУНОЛОГИЧЕСКИЙ ЖУРНАЛ, 2009, ТОМ 3(12), № 3-4, с. 303-309
ОРИГИНАЛЬНАЯ СТАТЬЯ
ИЗМЕНЕНИЕ ПАРАМЕТРОВ ФАГОЦИТОЗА ПОД ВЛИЯНИЕМ ФЛАВОНОИДОВ КОРНЯ СОЛОДКИ
© 2009 г. С.И. Павлова*/**, Р.С. Насибов**, А.Н. Шкопоров*, М.Д. Цицуашвили*, И.Г. Козлов*/**
*ГОУВПО Российский государственный медицинский университет Росздрава, кафедра фармакологии, Москва, Россия;
**ФГУ ФНКЦДетской гематологии, онкологии и иммунологии Росздрава, Москва, Россия
Поступила: 08.09.2009. Принята: 15.09.2009
Изучены эффекты препарата флавоноидов корня солодки (ФКС) на функции фагоцитов в моделях in vitro и in vivo. В моделях in vitro показано, что ФКС не подавляет поглотительную активность нейтрофилов и моноцитов, выделенных из периферической крови человека, но может снижать в них интенсивность окислительного «взрыва», индуцированного ФМА. ФКС способны уменьшать бактерицидную активность фагоцитов крови человека. В моделях in vivo ФКС не подавлял миграцию нейтрофилов и макрофагов.
Ключевые слова: флавоноиды, корень солодки, фагоциты
ВВЕДЕНИЕ
Флавоноиды — это большая группа фе-нилхромонов, обнаруживаемая практически во всех высших растениях. К настоящему времени идентифицировано более 4000 индивидуальных соединений флавоноидной структуры. В основе их химической структуры лежит система из конденсированных бензольного и гетероциклического колец с боковым фенильным заместителем. Изучению флавоноидов посвящено огромное число работ. Результаты исследований демонстрируют, что эти вещества обладают широким диапазоном активностей. В животных тканях флавоноиды не обнаруживаются, однако в системе in vitro они угнетают разнообразные ферментные системы животных и человека (в том числе эффективно ингибируют различные киназы сигнальных путей в клетке [1]), а in vivo проявляют противовоспалительные [2], иммунотропные [3], антиканцерогенные [4] и другие эффекты.
Ежедневное потребление флавоноидов с пищей (овощи, фрукты, чай, вино) может достигать сотен миллиграммов, однако, благода-
Адрес: 117997, г. Москва, ул. Островитянова, д. 1, кафедра фармакологии РГМУ. E-mail: pharma-3@yandex.ru
ря выраженному пресистемному метаболизму, терапевтически значимая концентрация этих веществ в плазме крови человека достигается в редких случаях. Последний факт является причиной того, что эффекты флавоноидов могут быть неоднозначными при разных способах введения экспериментальным животным.
В наших предыдущих работах были получены результаты, указывающие на иммуносу-прессивную активность препарата флавонои-дов корня солодки (ФКС) — дозозависимое антипролиферативное действие по отношению к активированным Т- и В- лимфоцитам в различных экспериментальных моделях. Так по результатам 3Н-тимидинового теста, ФКС в концентрации 20 мкг/мл практически полностью отменяли пролиферацию как мышиных, так и человеческих лимфоцитов, активированных митогенами. Парентеральное (внутривенное или внутрибрюшинное) введение ФКС в дозах 10 — 30 мг/кг значимо подавляло развитие реакции контактной чувствительности к динитрофторбензолу у мышей [5]. Эти результаты свидетельствуют о том, что ФКС могут являться потенциальным источником для создания новых препаратов с иммуносу-прессивной активностью.
В настоящее время наиболее перспективными являются исследования в области разработки менее токсичных и более специфичных иммуносупрессивных средств. В со-
временной клинической практике с иммуно-депрессивной целью широко используются цитостатики, глюкокортикостероиды и ингибиторы кальциневрина. Цитотоксические противоопухолевые средства (иммунодепрес-санты первого поколения) неизбирательно повреждают любые клетки, находящиеся в процессе деления. Этим объясняется наличие у этого класса лекарственных препаратов большого числа побочных эффектов. Внедрение ингибиторов кальциневрина явилось важным шагом в направлении создания более избирательных препаратов, однако побочные эффекты этого класса препаратов все еще значительны.
Идеальный иммунодепрессант, должен обладать избирательным действием на лимфоциты или их отдельные субпопуляции, не вызывая повреждения других клеток организма. Иначе говоря, действие препарата должно быть направлено преимущественно на клетки, принимающие участие в реакциях приобретенного иммунитета и являющиеся основным патогенетическим фактором аутоиммунных и атопических заболеваний.
Иммунитет для эффективного распознавания и удаления чужеродного работает во взаимосвязи систем врожденного и приобретенного звеньев. Врожденный иммунитет предупреждает внедрение микроорганизмов в ткани или, если они все-таки внедрились, способен удалить их до того, как включаться механизмы приобретенного иммунитета. Принцип функционирования системы врожденного иммунитета — это развитие реакций воспаления и фагоцитоза. Фагоцитирующие клетки (макрофаги и нейтрофилы) являются наиболее ключевым участником функционирования врожденного иммунитета. Поэтому целью данной работы стало изучение влияния препарата ФКС на функциональные возможности профессиональных фагоцитов в моделях in vitro и in vivo.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
Характеристика ФКС
В экспериментах использован препарат флавоноидов, полученный из экстракта корня солодки методом этанольной экстракции с последующим применением хроматографии на полиамидном сорбенте. Спектрофотомет-рический анализ образца ФКС показал наличие полос поглощения в области 250 — 280 и 300 — 380 нм, характерных для соединений
фенольного ряда. Концентрацию суммы фе-нольных соединений определяли фотометрическим методом при X = 750 нм в цветной реакции с реактивом Folin-Ciocalteu, используя галловую кислоту в качестве стандарта [6].
Выделение лейкомассы из периферической крови человека
К 2 мл цельной гепаринизированной крови добавляли 1 мл 3% раствора желатины на фосфатно-солевом буфере (ФСБ). После перемешивания оставляли на 15 минут при 37 °C для осаждения эритроцитов. Затем отбирали верхний слой лейкоцитов и отмывали ФСБ. При оценке параметров фагоцитоза in vitro лейкомассу преинкубировали 30 мин. в присутствии 20 мкг/мл ФКС.
Методы оценки фагоцитарной функции
1) Оценка поглотительной активности проводилась методом цитофлуориметрии [7] с использованием проточного цитометра Cytomics FC500 (Backman Coulter, USA). В качестве агента для фагоцитоза использовали убитый Staphylococcus aureus, меченный флуоресцеин-5-изотиоцианатом (ФИТЦ). Реакцию поглощения проводили в течение 30 мин. при 37 °C в присутствии 10% аутологи-ческой сыворотки. Рассчитывали фагоцитарный индекс — количество фагоцитов, поглотивших ФИТЦ-меченные бактерии, к общему числу моноцитов или нейтрофилов.
2) Оценка продукции активных форм кислорода проводилась цитофлуориметрическим методом в тесте форбол-12-миристат-13-аце-тат (ФМА)-индуцированного кислородного «взрыва» [7]. После 10-минутной преинкуба-ции лейкомассы с ФМА (0,1 °мкг/мл) вносили флуорогенный субстрат дигидрородамин-123 и инкубировали еще в течение 10 мин. при 37 °C. При анализе проб определяли процент активированных нейтрофилов и моноцитов, а также показатели спонтанной и стимулированной интенсивности флуоресценции.
3) Оценка бактерицидной функции фагоцитов осуществлялась классическим микробиологическим методом [8]. Для постановки реакции поглощения 100 мкл суспензии лейкоцитов в концентрации 106 клеток/мл (в пересчете на нейтрофилы и моноциты) и 10 мкл жизнеспособных бактерий (E. сoli) в количестве 107 клеток/мл инкубировали 20 мин. при 37 °C и 5% CO2 в присутствии 10% ауто-логической сыворотки. Непоглотившиеся бактерии удаляли с супернатантом после цен-
трифугирования в течение 5 минут при 250 g, процедуру повторяли дважды. Сразу после этого клетки в первой пробе лизировали сапонином, освободившиеся бактерии засевали на плотную питательную среду (Brain Heart Infusion Agar). Вторую пробу для осуществления реакции внутриклеточного киллинга инкубировали 90 мин. при 37 °C и 5% CO2, после чего проводили через все этапы, что и первую пробу. Через 24 ч после посева подсчитывали количество КОЕ в обеих пробах и рассчитывали процент погибших микроорганизмов (показатель бактерицидности).
4) Оценка миграции нейтрофилов и макрофагов проводилась в модели in vivo по выходу клеток в брюшную полость мышей BALB/c. С целью стимуляции выхода фагоцитов мышам внутрибрюшинно вводили стандартный индуктор миграции — 2% раствор пептона в объеме 2 мл. Через 24 и 72 ч животных забивали, брюшную полость тщательно промывали ФСБ, подсчитывали количество клеток. Подопытным группам животных вводили ФКС внутрибрюшинно в дозе 10 мг/кг трехкратно с 4-часовым интервалом за 1 ч до инъекции пептона. Для оценки эффекта рассчитывали индекс стимуляции (ИС) — количество клеток в брюшной полости при введении пептона и/или ФКС по отношению к клеточности на фоне внутрибрюшинного введении стерильного ФСБ.
Статистическая обработка результатов
Статистическую обработку проводили с помощью пакета анализа данных программного комплекса «Microsoft Excel 2007» путем расчета средней арифметической и средней ошибки средней арифметической. Для оценки достоверности различий использовали t-критерий Стьюдента, разницу считали достоверной при P < 0,05.
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
Поглотительная функция нейтрофилов и макрофагов, выделенных из периферической крови человека, была исследована цитофлуо-риметрическим методом. Изучение влияния ФКС на поглотительную активность фагоцитов показало, что даже предварительная обработка лейкоцитов препаратом ФКС in vitro не приводит к достоверному изменению процента фагоцитирующих нейтрофилов и моноцитов по сравнению с соответствующим контролем (рис. 1). Фагоцитарные индексы
в контрольной пробе составили 82,6±1,6% и 68,3±2,1% соответственно для нейтрофилов и моноцитов, а при инкубации клеток с ФКС в концентрации 20 мкг/мл этот показатель составил 82,2 ±1,6% (нейтрофилы) и 69,1 ±2,3% (моноциты). Результаты эксперимента свидетельствуют о том, что ФКС даже в концентрации, практически полностью ингибирующей пролиферацию митоген-активированных T-и B-лимфоцитов [5], не затрагивает поглотительную функцию фагоцитов человека.
Далее нами было изучено влияние препарата
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.